源于粉纹夜蛾的High-Five、Tn-368，这些细胞质生长较快，能够达到较高的细胞密度，适应悬浮培养，可以使用无血清培养基，是重组蛋白表达的理想宿主。由于昆虫细胞的N-糖基化与哺乳动物细胞有较大差异，人们设计了能够持续表达多种糖基转移酶的Mimic Sf9细胞，用以表达更高等生物的蛋白。
AcNPV的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表达4个阶段。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力；P10蛋白也是病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。如将外源基因取代多角体蛋白基因构成重组病毒，病毒体内不含有包含体。不形成包含体的病毒和形成包含体的病毒在平板中形成的空斑不同,利用这一特征筛选含有外源基因的重组病毒。
使用BEVS系统需要将外源基因整合入杆状病毒基因组中。解决这个问题主要有两种思路：Bac-to-Bac系统改造了AcNPV基因组，将之构建成为一个超大的穿梭质粒（130k），使其能够在大肠杆菌中复制（单拷贝），再将带有外源基因的供体质粒转入带有病毒质粒的大肠杆菌中，使它们在原核宿主体内完成重组过程，将表达盒插入多角蛋白启动子下游，纯化后感染昆虫细胞收集重组病毒；In-Fusion系统将野生型杆状病毒线性化，与带有外源基因和同源重组序列的载体直接共转染宿主细胞，只有正确重组的病毒才能进行自我复制并裂解宿主，以此来制备重组病毒。不论使用哪种方法，都需要在收集到大量重组病毒后再感染新鲜宿主，以获得高质量的重组蛋白。
4.1.2 稳定表达系统
InsectSelect系统和果蝇表达系统都是使用整合型质粒载体的重组蛋白表达系统。整合型载体可以实现重组蛋白的连续发酵，外源基因随机整合入染色体，表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，因此需要做大量的筛选工作才能获得稳定的表达菌株。
InsectSelect（IS）系统：
IS系统可以进行重组蛋白的昆虫细胞连续分泌培养。此系统使用的载体为pMIB/V5-His
A，B，C质粒，包括OpIE2、OpIE1启动子、蜜蜂蜂毒分泌信号肽（HBM）、灭瘟素抗性基因、C端V5抗原和His标签，以及在大肠杆菌中复制所必须的组分。
OpIE2、OpIE1启动子来源于杆状病毒OpMNPV，该病毒的天然宿主为冷杉合毒蛾Orgyia pseudotsugata，常用的表达宿主有Sf9、Sf21、High Five、Kc1（果蝇）、S2（果蝇）。OpIE2启动子比OpIE1强5-10倍，用于外源基因的表达，后者则用于灭瘟素抗性基因的表达。OpIE2为组成型强启动子，与HBM信号肽协同，使得重组蛋白能够在昆虫细胞中进行连续分泌培养。质粒C端有可选的V5抗原和His标签，方便重组蛋白检测和纯化。
外源基因插入载体后在大肠杆菌中扩增，纯化后转染宿主细胞。一旦宿主细胞成功表达重组蛋白，即可利用灭瘟素抗性进行筛选，获得高拷贝的细胞株进行连续发酵。
IS系统使用的质粒很小（3.6K），易于操作，表达流程相对简单，可以进行连续发酵，有些重组蛋白在IS中的表达量比BEVS还高，是一种比较实用的昆虫表达系统。
表3：昆虫表达载体pMIB/V5-His B质粒图谱
果蝇表达系统（Drosophila Expression System，DES)：
果蝇表达系统使用S2果蝇细胞为表达宿主，可以进行重组蛋白的胞内、分泌表达，可以连续表达。在培养瓶中，S2松散半贴壁单层生长，同时也可以很好的适应摇瓶和发酵罐的悬浮培养，可以使用无血清培养基。外源基因在S2细胞系一般能够达到500-1000个拷贝。DES有多种表达载体，包括组成型/诱导表达、胞内/分泌表达，可以适应不同的需要。
诱导表达的载体使用果蝇金属硫蛋白基因（MT）启动子。MT启动子是一个严紧调控的强启动子，即使在很高的拷贝数下也可以维持低水平的本底表达。硫酸铜或氯化镉可以解除抑制，表达MT启动子的下游基因。MT启动子在其他昆虫细胞系（如Sf9，Sf21，High Five）中表现不佳，仅能在S2细胞系中使用。
DES的表达载体均没有果蝇细胞的筛选标记，只能用于短期表达，要建立稳定表达的细胞株，必须将带有外源基因的载体和筛选载体共转染。常用的筛选载体有携带潮霉素抗性基因的pCoHygro和携带灭瘟素抗性基因的pCoBlast。将筛选载体和表达载体共转染宿主细胞，即可根据宿主耐药性选出高拷贝的细胞株。
图4：果蝇细胞表达载体pMT/V5-His质粒图谱
果蝇表达体统常用载体
pMT/V5-His pAc5.1/V5-His pMT/BiP/V5-His pMT/BioEase –DEST
启动子 MT Ac5 MT MT
表达类型 诱导 组成 诱导 诱导
细胞定位 胞内 胞内 分泌 胞内
融合标签 V5，His V5，His V5，His 生物素
表8：果蝇表达体统常用载体
4.2 昆虫细胞表达优化：
检查外源基因的一级序列：外源基因5’端不能有回文结构；密码子构成需要适应宿主的密码子偏好，特别是N端前几个；高AT含量的序列会使转录提前中止；检查重组蛋白序列，分泌表达时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr，避免蛋白N端出现―PEST‖——脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸，N端PEST使重组蛋白容易降解。
尝试各种外源基因-载体-宿主组合：不同的载体-宿主体统适合表达的蛋白是不同的，重组蛋白表达量不高时应多尝试几种组合。
宿主细胞状态：杆状病毒应在适合的时机感染宿主细胞，生长阶段、细胞密度、病毒量、收获时间都值得优化，特别是使用无血清培养基时，细胞密度要相应增加。诱导表达系统同样如此。
培养基：培养基成分对重组蛋白表达量和质量都有影响，可以考虑增加或减少培养基中某种组分（如血清等），也可以考虑将几种培养基按比例混合使用。
转速和溶氧量：娇嫩的昆虫细胞不一定能适应高转速培养，这就使培养基中的溶氧量受到了限制，优化转速使细胞状态达到最佳，发酵培养时还应优化培养基氧气饱和度，以提高外源蛋白的表达量。
共表达辅助因子：在杆状病毒表达系统中，过表达抗凋亡基因，如人源bcl-2和杆状病毒P35可以延长宿主寿命；P-vank-1基因则可以提高分泌表达量。
Recent patents on the Pichia pastoris expression system: expanding the toolbox for recombinant protein production. Recent patents on biotechnology 3, 192-201 (2009).
Cregg, J.M. et al. Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods in enzymology 463, 169-189 (2009).
Hamilton, S.R. & Gerngross, T.U. Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeast. Current opinion in biotechnology 18, 387-392 (2007). 5. 哺乳动物表达系统
与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N-糖基化和准确的O-糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。
5.1 表达宿主：
哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾（COS）细胞、人类肾细胞（293）、幼仓鼠肾细胞（BHK）等。不同宿主表达的重组蛋白其稳定性和翻译后修饰有所不同，需根据目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
CHO细胞是目前较常用的哺乳动物宿主细胞，被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS），广泛应用于医疗用重组蛋白的生产。它遗传背景清楚，生理代谢稳定，与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确，基因转移和载体表达系统完善，对剪切力的耐受性好，便于大规模培养，而且能在无血清和蛋白培养基中生长。缺点是产率较低，重组蛋白一般仅占细胞总蛋白的2.5%。CHO细胞有多种亚细胞株，如脯氨酸缺陷型CHO-K1、紫外线敏感型UV20、UV41，二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) CHO和转入了胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因、更加适应无血清培养基的超级CHO等。
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时最常用的宿主，源于1-1细胞株，基因组内含有腺病毒SV40的T抗原基因，允许SV40进行裂解生长，允许SV40早期突变体的复制。COS细胞载体易于构建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什么限制，可以通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。
来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)，悬浮培养时重组蛋白产率可以达到细胞总蛋白量的20％，在细胞单层贴壁培养情况下表达量也可达到10 mg/L。在多种肾细胞获得成功后，人源肾脏细胞293细胞也经过改造成为常用的表达宿主。293细胞株整合