简化了纯化步骤。
表达菌株：
毕赤酵母的表达菌株都是由野生型石油酵母NRRL-Y11430改造而来，含有一种或几种营养缺陷（如his4、arg4等）以方便筛选（表6）。研究发现，敲除了AOX基因的菌株有时能更好的表达外源蛋白，而且诱导所需的甲醇量也大大降低了。按照AOX基因的敲除情况和利用甲醇的能力，毕赤酵母表达菌株可以分为3类：在甲醇培养基中快速生长的Mut+；敲除了AOX1，在甲醇培养基中慢速生长的MutS和敲除了两个AOX基因，不能利用甲醇的Mut-。不同的表型可以用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。除此之外，还有敲除了蛋白酶（prb1、pep4）的菌株，以保护重组蛋白不受宿主蛋白酶的攻击。蛋白酶缺陷型的菌株生长比较缓慢。
与酿酒酵母相同，毕赤酵母也可以进行二硫键形成、磷酸化、乙酰化、糖基化等翻译后修饰，也只能利用甘露糖残基对蛋白进行糖基化修饰。毕赤酵母的N-糖基化糖链较短，平均每个支链8-14个甘露糖残基，有利于重组蛋白的分子均一性；而且糖链中和糖链末端都没有1,3-甘露糖，对重组蛋白抗原性的影响也比酿酒酵母低。
毕赤酵母表达菌株
X-33 GS115 KM71 KM71H MCIO0-3 SMD1163 SMD1165 SMD1168 SMD1168H
甲醇利用表型
Mut+ Mut+ MutS MutS Mut- Mut+ Mut+ Mut+ Mut+
营养缺陷
- 组氨酸缺陷 组氨酸、精氨酸缺陷
精氨酸缺陷 组氨酸、精氨酸缺陷
组氨酸缺陷 组氨酸缺陷 组氨酸缺陷
-
蛋白酶敲除
- - - - -
PEP、PRB敲除 PRB敲除 PEP敲除 PEP敲除
表6：常用毕赤酵母表达菌株
表达载体：
毕赤酵母本身没有质粒，自主复制型载体通常不稳定，因此一般采用整合型载体。整合型载体的外源基因表达盒由几部分组成：AOX启动子、多克隆位点、融合标签、AOX终
止子，有时还有一段AOX1基因的3’端非编码区，以便将外源基因表达盒导入基因组中的AOX1位点。一些载体还含有外分泌信号肽，使重组蛋白分泌至培养基中。某些载体允许构建多个串联的外源基因表达盒，以弥补整合型载体拷贝数量的缺陷。组成型表达的GAP启动子可以替代AOX启动子：GAP启动子不需要甲醇诱导，表达水平较高，操作简单，但不能表达对宿主有高毒性的蛋白。
除表达盒之外，载体上还有筛选标记（营养缺陷互补基因、抗生素抗性基因）和在细菌中进行拷贝增殖所必须的序列（启动子、终止子、复制子、抗生素抗性基因等）。遗传霉素G418抗性和博来霉素Zeocin抗性是常用的抗生素筛选标记，常用于外源基因多拷贝的筛选。博来霉素抗性由于基因很小（375bp），易于操作，而且也能对原核宿主进行筛选，逐渐成为人们偏爱的筛选标记。
载体质粒需要首先进行线性化，才能重组到宿主染色体中。克隆载体上一般有多个线性化酶切位点供选。基因重组可以发生在基因组中AOX基因区域和相应的质粒AOX区域之间，包括AOX启动子、终止子和3’非编码区。通过选择不同的线性化位点控制重组和外源基因的插入，可以导致宿主的不同甲醇利用表型（Mut+/Muts）。如选择AOX启动子和3’端非编码区的酶切位点，会导致染色体中的AOX基因被置换下来，使Mut+表型的宿主变为Muts。如果需要多拷贝的外源基因，可以使用带有HIS4基因的载体，并选择HIS4中的酶切位点进行线性化。这个线性化位点不会影响宿主的甲醇利用表型，最终得到的表达菌株表型与宿主相同。
图2：酵母表达载体pPIC9K质粒图谱
常用毕赤酵母表达
载体
pPIC3.5 pPIC3.5K pPIC9 pPIC9k pAO815 pHIL-S1 pHIL-D2 pPIC6A,B,C pPIC6αA,B,C pPICZαA,B,C pPICZA,B,C pGAPZαA,B,C pGAPZA,B,C
启动子 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 AOX1 GAP GAP
拷贝数 分泌信号肽 低 高 低 高 高 低 低 低 低 低 低 低 低
- - α因子 α因子 - PHO1 - - α因子 α因子 - α因子 -
筛选标记 HIS4 HIS4，遗传霉
素
HIS4 HIS4，遗传霉
素
HIS4 HIS4 HIS4 灭瘟素 灭瘟素 博来霉素 博来霉素 博来霉素 博来霉素
融合标签
- - - - - - - c-myc抗原，
His c-myc抗原，
His c-myc抗原，
His c-myc抗原，
His c-myc抗原，
His c-myc抗原，
His
表7：常用毕赤酵母表达载体
3.2 表达条件的优化：
检查外源基因的一级序列：5’端不能有回文结构；密码子构成需要适应宿主的密码子偏好，特别是N端前几个，如使用了酵母厌恶的密码子会大大影响表达量；高AT含量的序列会使转录提前中止；检查重组蛋白序列，分泌表达时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr。
宿主表型：尝试Mut+/MutS/Mut-表型的宿主，不同的基因在不同的宿主菌中可能表达量截然不同，多试几种菌株，挑选最优的表达体系。胞内表达尽量使用MutS和Mut-的宿主菌，以降低乙醇氧化酶的表达，提高重组蛋白产率。
多拷贝转化子的筛选：在使用pPIC3.5、pPIC9等多拷贝载体时，需要对转化子进行大量的筛选工作。以抗生素为筛选标记时，由于酵母的耐受能力与细胞密度有关，可能会出现假阳性，对挑选出来的高抗性转化子，还应做进一步的PCR验证，也可以省略平板筛选，
直接做PCR鉴定。高克隆并不能一定带来高表达，表达菌株的最终确定应以表达量为准。在表达分子量不大的蛋白时可以考虑换用pAO815载体，pAO815可以精确控制外源基因拷贝数，一次转化即可获得含有正确数目插入的转化子，从而省去了转化子的筛选工作，其缺点是克隆复杂，载体较大。
细胞定位：不是所有蛋白都适合分泌表达，如果重组蛋白本身定位于胞质中而且没有糖基化位点，应该尝试胞内表达。
培养基：重组蛋白分泌表达时，最好选用pH可在较宽范围内变化的磷酸缓冲液培养基，优化培养基pH值能提高蛋白表达量和稳定性。基本培养基可以简化纯化过程，丰富培养基则使表达菌株的生长更好，还有助于稳定重组蛋白，表达量偏低时最好使用丰富培养基。培养基中的甘油浓度有时也会影响重组蛋白的表达量和活性，甘油浓度过高会影响培养基溶氧量，需注意。
甲醇浓度：不同的宿主-载体-重组蛋白体系的最优甲醇诱导浓度是不同的，从0.5%-5%都有可能，是需要优化的一个重要表达条件。摇瓶培养时甲醇浓度不易监测，需要根据经验补加；发酵培养则可以实现甲醇浓度的精确控制，有利于重组蛋白的高表达。
细胞密度：提高细胞密度能够显著提高重组蛋白的表达量。在培养基中添加不会抑制AOX启动子的碳源，如山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、丙氨酸等，可以提高生物量。摇瓶培养效果不佳时，可以考虑发酵培养。
蛋白酶：酵母细胞中有多种蛋白酶，也会分泌一些中性蛋白酶至培养基中。如果重组蛋白对这些酶敏感，可以通过几种方法减轻蛋白酶的影响：降低培养基pH值，使蛋白酶失活；提高培养基中的蛋白含量，加入1%酪蛋白水解物，用杂蛋白保护重组蛋白；换用蛋白酶敲除的宿主菌。
溶氧量：越高越好。毕赤酵母的生长对氧气要求不高，高效表达则需要大量氧气。使用摇瓶表达时，减少培养基体积并提高转速可以显著提高菌液溶氧量，如果培养基中加有抗生素，甚至可以去掉棉塞，只用4-8层纱布封口。
温度：培养温度超过30℃将使酵母的生长和表达趋于停滞，如果摇床或发酵罐温度不稳，设置在28℃。
过糖基化：重组蛋白的过糖基化不仅影响均一性，而且有时还会影响表达量。尝试胞内表达、敲除N-糖基化位点可以降低重组蛋白的糖基化水平，也可以在纯化时加入酶切除过长的糖链以提高蛋白均一性。
菌株老化：表达菌株多次传代后表达量会明显降低，有时表达第一次、第二次产量都
很高，然后突然下降。长期表达时应注意保持菌株的新鲜：用原始菌株多做一些甘油菌，-80℃冻存，每次表达之前都取出一管重新划线。
重组蛋白不分泌或分泌量低：在分泌之前，重组蛋白必须正确折叠并形成正确的二硫键，错误和不当折叠都会干扰分泌通路。共表达辅助因子，如分子伴侣（Hsp70、90家族）、二硫键异构酶Pdi，过表达未折叠蛋白相应转录因子Hac1p（诱导分子伴侣和分泌通路酶的表达）等方法可以帮助重组蛋白进入分泌通路，提高分泌表达量和蛋白活性。
4. 昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达体统适宜表达高等真核生物蛋白。昆虫细胞在培养中可以达到较高的细胞密度，具有复杂的翻译后修饰，如蛋白质的正确折叠与切割、二硫键形成、糖基化、磷酸化、酰化、酰胺化、羧甲基化等，很多修饰过程与哺乳动物都是相同的。与酵母相同，昆虫细胞也可以进行胞内和分泌表达，启动子很强，重组蛋白表达量高，而且更适宜表达多元蛋白复合物。
昆虫细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染可以获得稳定的转染细胞，但实验周期较长，需几周甚至几个月时间，适宜连续发酵培养；利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，适用于目的蛋白的表达检测。
4.1 昆虫细胞表达系统
目前常用的昆虫细胞表达系统有杆状病毒-昆虫系统、InsectSelect稳定表达系统和果蝇表达系统三种。
4.1.1 杆状病毒-昆虫（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）表达系统：
杆状病毒（baculovirus）是一类以昆虫细胞为天然宿主的核型多角体病毒，其基因组为80-160kb大小的单一闭合双链超螺旋DNA，约编码154个基因。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (AcNPV)。AcNPV基因组具有较大的柔韧性，可以容忍较大片断的外源基因和多个外源基因的插入，病毒感染后期，宿主细胞会被裂解，因此BEVS不适于连续培养。
AcNPV能够感染大约30种鳞翅类昆虫细胞，在一定条件下也可以感染果蝇细胞，其中草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda， Sf)卵巢细胞和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎细胞被发展成最常用的表达宿主。杆状病毒常用的表达宿主有来源于草地贪夜蛾的Sf9、Sf21和来