了人类腺病毒5DNA的片段，显著强化了宿主的部分启动子，使得重组蛋白可以达到较高的表达量。293细胞能在无血清培养基中生长，其变种有快速生长型293-F、整合了猴腺病毒大T抗原的293-FT、融合了腺病毒部分基因的AD293和HEK293、贴壁好适宜锚定筛选的293-H等。
5.2 表达载体
与酵母和昆虫细胞类似，哺乳动物细胞表达外源重组蛋白也可以利用质粒转染和病毒载体的感染。
病毒载体
哺乳动物可用的病毒载体很多，有猿猴空泡病毒（SV40）、腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus）、人牛痘病毒（Vaccinia virus）、杆状病毒（Baculovirus）、冠状病毒（Coronavirus）、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus）、慢病毒（Lentiviruses）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、逆转录病毒（Retroviruses）、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）等。不同的病毒载体能够裂解增殖或复制的宿主各不相同，应根据需要选择。
腺病毒（Adenovirus）：
腺病毒为线状双链DNA病毒，基因组长36kb，DNA两端各有一个反向重复序列ITR。腺病毒宿主范围广，可感染一系列哺乳动物细胞，其中人源细胞是腺病毒的允许细胞，腺病毒可以完成复制增殖裂解宿主的周期，不会插入人源细胞基因组中，因而不会致癌；而对啮齿动物，大部分腺病毒都可以致癌。腺病毒基因按转录时间的先后，可以分为早期（E1-E4）和晚期转录单位（L1-L5）。E1蛋白调节细胞代谢并激活其他早期基因的启动子，E2启动病毒DNA复制，E3与病毒复制无关，主要帮助病毒的成熟，E4主要与病毒mRNA的代谢有关。
pAdEasy-1载体以人腺病毒AD5基因组为蓝本，敲除了E1和E3，扩大载体容量的同时，使病毒不能在非允许细胞中复制。目的基因首先克隆在一个带有ITR和筛选标记的穿梭质粒（如pShuttle-CMV）中，线性化后与pAdEasy共转染大肠杆菌，以抗生素筛选带有重组病毒的原核宿主，提取纯化后在融合有腺病毒E1基因的293细胞株（如AD293）中增殖和表达。重组病毒中，表达盒插入在腺病毒E1区，使用E1强启动子表达重组蛋白。
使用人源细胞株作为表达宿主时，腺病毒载体最终会裂解宿主，因此不适于连续表达。
慢病毒（Lentivirus）：
慢病毒是逆转录病毒的一种，由潜伏期较长而得名。慢病毒既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括造血干细胞，神经干细胞，处于分化终末的神经元，肝实质细胞等。根据其来源不同，慢病毒可以分为以下几类：HIV I型、HIV II型、猿类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒。其中HIV I型是目前最常用的慢病毒载体。慢病毒感染宿主细胞后马上形成前病毒，前病毒的主要基因编码区为
5’LTR-Ψ-gag-pro-pol-env-3’LTR，其中LTR为长末端重复序列、Ψ为整合信号，gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。
HIV-I载体系统由辅助和载体两个质粒组成。载体质粒含有整合信号Ψ、启动子、多克隆位点以及包装、逆转录和整合所需的序列；辅助质粒则与载体互补，编码了产生病毒颗粒所必须的蛋白。将两个质粒共转化到宿主中，由于辅助质粒不含整合信号，新生成的病毒中就只有目的基因。将重组病毒感染普通表达宿主，即可进行重组蛋白的稳定表达；如感染整合了gag、pol、env基因的宿主，即可进行瞬时表达。
慢病毒表达系统的一个主要缺陷是：载体和辅助质粒有时会在宿主中发生同源重组，产生野生型病毒。为了解决这个问题，目前使用的表达系统将辅助质粒又分成了三个质粒，分别带有逆转录酶rev基因、gag和pol基因、以及env的替代基因VSV-G（囊口腔炎病毒外壳蛋白）。将载体系统分成4个部分增加了野生病毒生成所需的重组步骤，使得HIV载体系统更加稳定；外壳蛋白的单独构建，使得人们可以通过更换病毒外壳蛋白质粒来方便的更换宿主种类。
单质粒表达载体
以pcDNA3.1为例，它是一个不依赖病毒的载体，组成元件有人巨细胞病毒早期启动子pCMV、多克隆位点、用于真核筛选的遗传霉素抗性基因、f1和SV40复制子、polyA转录终止信号，以及原核复制子和氨苄青霉素抗性基因。
pcDNA3.1载体的使用与类似的昆虫表达载体相同：将目的基因克隆入载体中，在原核宿主中扩增纯化，转染真核表达宿主，使用G418筛选高表达细胞株。pcDNA3.1载体很小（5.4kb），易于操作，宿主溶源SV40病毒时可以独立于染色体自主复制；但是其表达流程复杂，对质粒载体纯度和转染效率要求很高，筛选工作费时费力，而且表达盒的插入位点和拷贝数不可控制，可能影响宿主生理性质。使用Flp-In宿主细胞株可以克服这些缺点。
图5：A：Flp-In CHO细胞系；B：pEF/FRT/V5-DEST质粒图谱
常用的哺乳动物细胞株，如CHO、293等都可以改造为Flp-In细胞株。序列SV40启动子—ATG—FRT—lacZ-Zeocin整合在基因组中活跃表达的区域（图5 A），使用博来霉素筛选宿主基因型，带有外源基因的表达盒插入FRT位点，保证了目的基因的正确整合。使用Flp-In细胞株必须配合表达pOG44质粒和带有FRT重组序列的表达载体，如
pEF/FRT/V5-DEST（图5 B）。pOG44带有编码了Flp重组酶的基因，将其与表达载体共转染，Flp重组酶帮助表达盒插入宿主染色体的FRT位点，即可获得稳定表达重组蛋白的细胞株。
除以上介绍的两种载体外，还有多种单质粒载体可供选择（表9）。
载体
pcDNA3.1/V5-DEST
pcDNA3.2/V5-DEST pcDNA6.2/V5-DEST pcDNA6.2/GFP-DEST pcDNA-DEST40
启动子 CMV CMV CMV CMV CMV
融合标签 筛选标记 V5 V5 V5 GFP V5,His
新霉素 新霉素 灭瘟素 灭瘟素 新霉素
其他
带有TEV蛋白酶切位点
pcDNA-DEST47 pcDNA-DEST53 pDEST26 pDEST27 pEF-DEST51 pEF/FRT/V5-DEST CMV CMV CMV CMV hEF-1α hEF-1α GFP GFP His GST V5,His V5 新霉素 新霉素 新霉素 新霉素 灭瘟素 潮霉素
带有FRT重组序列
表9：常用哺乳动物单质粒表达载体，新霉素是遗传霉素类似物，也可用G418筛选
四环素诱导表达系统：
四环素诱导表达载体是基于大肠杆菌四环素操纵子而设计的。大肠杆菌中，四环素抗性蛋白（TetR）调控着Tn 10转座子上的四环素抗性操纵子。TetR结合在tet操纵序列（tetO）上，抑制下游基因的转录。当环境中存在四环素时，四环素结合在TetR上，使其构象发生改变，从DNA上脱落而解除抑制。TetR和tetO为哺乳动物四环素诱导表达系统提供了调控与诱导表达的基础。
哺乳四环素诱导表达系统有两种：Tet-On和Tet-Off（图6）。Tet-On系统在培养基中添加Dox（四环素类似物）时诱导外源基因表达；Tet-Off则在培养基去除Tet或Dox时诱导外源基因表达。这两种系统都由2个质粒组成：带有经过改造的TetR的调控质粒和tetO及目的基因的表达质粒。
在Tet-Off的调控质粒中，TetR的N端1-207与单纯疱疹病毒VP16的活性结构域（TA）融合，形成一个新的转录调控蛋白tTA。tTA的功能与TetR相反，是一个转录激活因子，结合四环素或Dox时不能结合DNA，表达被抑制，去除配体时蛋白结合在操纵序列上，诱导外源基因表达。
在Tet-On的调控质粒中，tTA经过4个氨基酸残基的突变，被改造成抑制转录的―反向‖tTA（rtTA）。rtTA只应答Dox，四环素不能启动转录。结合有Dox的rtTA能够同时结合操纵序列并启动转录，反之则从DNA上脱落，抑制转录。
除调控蛋白编码基因外，两个系统的调控质粒上还带有CMV启动子、新霉素抗性基因、polyA终止子、氨苄青霉素抗性基因及原核复制子Col E1。可以使用G418筛选稳定转染的细胞株。
Tet-On和Tet-Off系统共用一种表达质粒。其中，tetO的连续7个拷贝和最小化的CMV启动子组成了Tet应答启动子hCMV*-1，当调控蛋白（tTA或rtTA）结合在启动子上时，下游的外源基因得到转录。将调控质粒和表达质粒共转染宿主细胞，利用G418筛选，即可获得诱导表达重组蛋白的稳定细胞株。由于四环素和Dox的半衰期较短，使用Tet-On系统需
要在诱导后定时添加Dox，Tet-Off则需要在诱导前定时补加。
四环素诱导表达系统有很多优点：严紧调控，本底表达量低；使用转录激活蛋白而不是抑制蛋白，进一步降低了本底表达，并减少了响应时间；特异性强，操纵子来源于原核生物，与表达宿主的同源性很低，调控蛋白只结合表达质粒上的操纵序列；表达量与诱导剂浓度正相关，可以较精确的控制。
除基本的Tet-On/Off系统外，还有严紧调控的pTRE-Tight载体、带有报告基因的pTRE-Tight-DsRed2载体、经过进一步改造更加适应哺乳动物宿主的Tet-On/Off 3G载体等，使用时可以根据需要选择。
图6：Tet-Off和Tet-On诱导表达系统