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2.1.3 主要试剂
表2-1 主要试剂
主要试剂 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂粉 异戊醇 苯酚 无水乙醇 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 硫酸铵 冰乙酸 硫酸镁 硝酸钾 硫酸亚铁 无水氯化钙 葡萄糖 氯仿 EB
细菌基因组DNA快速抽提试剂盒
Taq酶 超纯dNTP DH5α Competent Cell pUC-T Ligasing Kit
SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒 Axyprep质粒DNA小量试剂盒
生产厂家、 宜兴永信生物有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 上海申翔化学试剂有限公司 福建省石狮市前坑琼脂加工厂
江苏徐州腾狮化工厂 汕头市西陇化工厂有限公司 江苏徐州腾狮化工厂 上海申翔化学试剂有限公司 上海申翔化学试剂有限公司 天津市瑞金化学试剂有限公司 上海苏懿化学试剂有限公司 天津市福晨化学试剂厂 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市福晨化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市福晨试剂有限公司 上海申翔化学试剂有限公司 生工生物工程（上海）有限公司
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2.1.4 主要仪器与设备
表2-2 主要仪器
主要仪器与设备
三角瓶 90mm平板 烧杯 移液枪 接种针 涂布棒 玻璃棒 量筒 试管 试管塞 酒精灯 纱布 无菌棉 电炉 电子天平 电磁炉 数显恒温水浴锅
灭菌锅 恒温培养箱 DL-5低速大容量离心机 GZX-DH﹒600-Ⅱ电热恒温干燥箱
冰箱 无菌操作台 DYCZ-24D电泳槽 DYY-12型电泳仪 HJ-3数显恒温磁力搅拌器
pH-3C精密pH计
生产厂家 实验室自备 上海五一玻璃仪器厂
实验室自备 大龙医疗设备有限公司
实验室自备 实验室自备 实验室自备 实验室自备 实验室自备 实验室自备 实验室自备 徐州卫生材料厂有限公司 徐州卫生材料厂有限公司 上海树立仪器仪表有限公司 上海越平科学仪器有限公司
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江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
上海雷磁仪器厂
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2.2 实验方法
2.2.1 菌种分离
2.2.1.1 样品稀释液的准备
称取1g样品，无菌操作倒入99mL灭了菌的生理盐水中，经充分振荡10-2成均匀稀释液。再换用lmL移液器，吸取10-2稀释液0.5mL，移入装有4.5 mL灭了菌的水的EP管中，振荡，使菌液充分混合均匀，即成10-3稀释液；再换一支灭了菌的枪头，吸取10-3稀释液0.5mL，移入装有4.5mL无菌水的EP中，振荡，使菌液充分混合均匀，即为10-4稀释液；按以上办法，连续稀释，制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液[8]。 2.2.1.2 涂布
用移液枪吸取10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液各0.10mL接种在不同稀释度编号的平板上，每个编号设两个重复。然后灭过菌的涂布棒将菌液在平板上涂布均匀；涂下一个稀释度时，需要将涂布棒在酒精灯上灼烧灭菌。分别取0.10mL不含样品的稀释液加入两个灭菌平皿内作空白对照[9]。 2.2.1.3 培养
将涂布好的平板平放于桌上，使其自然晾干，然后，将平板在37℃倒置培养1-2d。 2.2.1.4 菌落计数及报告方法
计数时应选择菌落数在30~300/皿之间的稀释倍数进行计数，若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时，而另—半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用[10,11]。 2.2.1.5 连续划线分离
用灭过菌的接种环蘸取10-4稀释液于平板上划线。在平板的一边划三道线。转动培养皿约70°角，将接种环在火上烧过灭菌并冷却后，再划三道线。同法进行第三次、第四次划线。 2.2.1.6 培养
牛肉膏蛋白胨培养基在37℃培养1-2d。
2.2.2 生理生化
2.2.2.1 淀粉水解实验
原理：在淀粉固体培养基上接种四种细菌，培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝
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色，而是无色透明圈。
具体步骤：
（1）配好培养基后灭菌，在无菌条件下制成平板并冷却。
（2）用记号笔在三个平板底部作标记，分别为FX-1，FX-2，FX-3。
（3）将FX-1，FX-2，FX-3在无菌操作下点种到所对应的标记区域内，接种个平板。
（4）将平板倒置在37℃的培养箱中培养24h。
（5）观察各菌种的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均与铺满整个平板，观察菌苔周围出现无色透明圈。 2.2.2.2 甲基红实验
原理：很多细菌，能够分解葡萄糖，产生丙酮酸，这种物质又可以再次被分解，产生各种酸，这样，培养基的pH会降低到4.2以下，加入甲基红指示剂后，会变成红色。因为可以让甲基红指示剂变色的范围是pH4.4(红色)～pH6.2(黄色) [12]。
具体步骤：
（1）葡萄糖蛋白胨水培养基的制作: 葡萄糖 0.5g，蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.2g，水100mL，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min。
（2）用接种针FX-1，FX-2，FX-3接入3支蛋白胨水培养基和两支葡萄糖蛋白胨水培养基，置37℃培养48h用记号笔在各试管外壁上分别标明。
（3）将这3支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。 2.2.2.3 糖发酵试验
原理：不同的细菌利用糖的能力存在差异。表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的基础。溴甲酚紫是一种酸碱指示剂，在中性时为紫色，碱性时为深红色，而在酸性时呈现黄色。在糖发酵培养基中加入指示剂，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断[13]。
具体步骤：
（1）将配置好并标明培养基名称的发酵培养基灭过菌后冷却到一定的温度。 （2）用记号笔在个试管壁上标记FX-1，FX-2，FX-3。
（3）取葡萄糖发酵培养基试管4只，分别按其试管上所标记的菌名接种相应的菌种,另一只不接种，作为空白对照。
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（4）将接种过的试管连同2只空白对照试管置于37℃的培养箱中培养24-48h。 2.2.2.4 吲哚试验
原理：某些细菌它体内有色氨酸酶，能够分解蛋白胨水培养基中的色氨酸（靛基质），生成吲哚。加入吲哚试剂（又称对位二甲氨基苯甲醛）后，会形成玫瑰吲哚而成红色，则为阳性[14]。
具体步骤：
（1）用接种针将FX-1、FX-2，FX-3分别接入3支培养基中，置37℃中培养48h。 （2）另一只不接种，作空白对照。
（3） 经过48h的培养后，按要求向向试管内加入3~4滴乙醚并摇动数次后静置1min，之后乙醚上升并形成一大致1~2mm厚的乙醚层，然后沿试管壁慢慢加入2到3滴吲哚试剂后，如果为阳性反应，则会在乙醚和培养物之间产生红色环状物。 2.2.2.5 明胶液化实验
原理：明胶是一种动物蛋白质，高于24℃成液体，低于20℃成固体。某些细菌具 明胶酶，使明胶被分解，失去凝固能力，即使低于20℃也呈现液体状态，即为阳性。 具体步骤：
（1）取FX-1，FX-2，FX-3纯培养物少许，用接种针分别穿刺接种到明胶培养基中。 （2）另一只作空白对照，不接种。
（3）置37℃培养5～7天。观察培养基液化情况。
（4）37℃明胶呈液状，所以观察结果时，将培养基轻轻放入4℃冰箱中30min，此时
明胶又凝固。如果放置在冰箱中30min仍然不凝固，就说明明胶被试验细菌液化，为阳性。
2.2.2.6 尿素酶（Urease）试验
原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。 具体步骤：
（1）将FX-1，FX-2，FX-3穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。
（2）放在37℃培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。
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