徐州工程学院毕业设计(论文)
2.2.3 分子生物学方法鉴定
2.2.3.1 细菌基因组DNA的提取[15,16]
A.细菌基因组DNA快速提取试剂盒组成
表2-1 试剂盒组成
组成 Buffer Digestion Buffer PB TE Buffer(pH8.0) Enzymatic lysis buffer B.提取步骤
SK8225,50次
24 mL 12 mL 10 mL 10 mlL
SK8226,100次
48 mL 24 mL 20 mlL 20 mL
（1）各取1mL过夜培养的细菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8,000rpm离心1mL弃上清，收集菌体。加入400uL Buffer Digestion，使其混匀。65℃水浴1h直到其中的细胞完全裂解。
（2）加入200uLBuffer PB，颠倒使其充分混匀。在-20℃的冰箱中放置5分钟。 （3）室温10，000rpm离心5min,将上清液500uL转移到新的1.5mL离心管中。 （4）加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，在室温中放置2-3min。用室温10,000rpm离心5min，把上清倒掉。
（5）加入1mL 75％乙醇，颠倒漂洗1到3分钟，室温下10,000rpm离心2min，把上清倒掉。
（6）重复步骤5一次
（7）打开盖子在室温下倒着放置5-10min，使其中的乙醇完全挥发。
（8）然后用50-100uLTE Buffer 使剩下的物质溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或20℃保存。 2.2.3.2 基因组的PCR扩增[17]
（1）在200μL PCR管中依次加入下列试剂：
11
徐州工程学院毕业设计(论文)
表2-2 PCR体系组成
试 剂 灭菌的重蒸去离子水 10× Taq plus Buffer(含Mg2+) dNTP Mix (10mmol/L each) 10 pmol/μL 上游引物 10 pmol/μL 下游引物
DNA 模板
Taq plus DNA polymerase（5 U/μL）
Total volume
体积（μL） 68.00 10.00 8.00 6.00 6.00 1.00 1.00 100.00
说 明 试剂按顺序加入PCR管，在冰上操作。
（2）4℃短暂离心，使液体集中在管的底部；
（3）将PCR管置于PCR仪中按下列程序循环： Lid 104℃ 热变性 94℃ 2min 变性 94℃ 55s
复性 55℃ 55s 35Cycles 延伸 72℃ 1.30min 延伸 72℃ 510min 2.2.3.3 PCR结果检测
将配置好的琼脂糖凝胶倒入到电泳仪的电泳槽中，待其凝固后放入拔掉梳子。吸取5ul的PCR样品与一定量的上样Buffer混合，加入上样孔中，将电泳槽放在冰盒中，120V进行电泳，跑至槽的2/3时结束电泳。将跑完样的凝胶放入到EB染色液中进行15min，然后将胶放在凝胶成像仪中观察结果[18]。 2.2.3.4 PCR产物的纯化
将有PCR成功的产物放入到试剂盒中进行反应，把引物、酶等杂物出去，获得纯化后的产物。
2.2.3.5 大肠杆菌感受态的制备
挑取大肠杆菌单菌落，接种于10ml液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜，按1%接种于10mL液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养2-3h至OD600为0.4-0.6。将发酵液转入2个50mL无菌离心管中，冰水浴放置10min，然后4℃、5000rpm离心10min，
12
徐州工程学院毕业设计(论文)
弃去上清。在沉淀物中加入75mmol/L CaCl2溶液悬浮细胞，在一系列的处理后，4℃、5000rpm离心10min，弃去上清。每管加入预冷的15%甘油-CaCl2溶液2mL，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液。 2.2.3.6 转化
各取100uL感受态细胞悬液，置冰水浴使其解冻。加入连接产物10uL，轻轻摇匀，冰水浴40min。置于42℃水浴中热冲击45s，孵育1min。放置一段时间后，去100uL涂布于含Amp的LB培养基上，37℃下培养过夜。用牙签挑出长出来的菌落接入含Amp的LB液体培养基中培养过夜。 2.2.3.7 质粒的提取
步骤:
（1）在5 mL附加相应抗生素的LB液体培养基中接入一单菌落，37 ℃振荡培养过夜； （2）将1.5 mL培养物倒入1.5 mL离心管中，室温以1 2000 rpm离心1 min，收集菌体，倒掉上清；
（3）再次将1.5 mL培养物倒入该1.5 mL离心管中，室温以1 2000rpm离心1 min，收集菌体，倒掉上清；
（4）倒掉上请，吸干残余，加入200 μL预冷的溶液Ⅰ，剧烈用枪头吹打悬浮； （5）加入200 μL不需预冷的溶液Ⅱ(新配)，轻摇混匀（动作要缓慢），溶液呈澄清透明状；
（6）加入200 μL 4 ℃预冷的溶液Ⅲ，轻摇混匀（动作要缓慢），冰上放置10 min； （7）1 2000rpm离心10 min，小心吸取上清于新管。（若质粒仅为鉴定用，则从这一步直接跳至第9步）；
（8）加入水饱和酚300μL，充分混匀，再加入300μl氯仿并混匀，再以1 2000 rpm离心6 min，转移上清至新管；
（9）加入600μL氯仿，混匀，再次1 2000rpm离心6 min，转移上清到新管； （10）加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20 ℃ 20 min沉淀DNA； （11）以1 2000 rpm离心15 min，小心吸去上清液；
（12）用500μL 70%乙醇洗涤沉淀1次，再用500μL无水乙醇洗涤一次弃上清，吸干残余，空气中干燥DNA沉淀；
（13）用含RNAse A（20μg/mL）的TE 20 μL溶解，37 ℃消化1小时，-20 ℃储存备用。
13
徐州工程学院毕业设计(论文)
2.2.3.7 16SrDNA测序[19-21]
将成功提取的质粒，送去南京生物工程有限公司测序。将所测得的16SrDNA序列经过校对后与NCBI上的GeneBank序列数据库中的已有序列进行Blast分析，根据序列同源性从高到低的次序选取模式菌株的序列，以确定该菌株的分类地位。
14
徐州工程学院毕业设计(论文)
3 结果分析
3.1窑湾甜油菌落总数的计数
接种0.1 mL 稀释液在平板上，培养。肉眼观察到稀释度为10平板上的菌落总数为
-4
56，即稀释液每100μm菌液中有56个菌。菌落总数可表示为56×104×10=5.6×106。由此可以得出：每一克窑湾甜油约含有5.6×106个细菌。其中观察到有三种不同形状的菌落，分别取名为FX-1，FX-2，FX-3。
表3-1 三种细菌的菌落形态
FX-1 FX-2 FX-3
形状 圆形 圆形 圆形
颜色 白色 白色 白色
表面 不光滑，很干 不光滑，很干
光滑
边缘 不完整 完整 完整
透明度 不透明 不透明 不透明
菌落总数 2.2×106CFU 2.0×106CFU 1.4×106CFU
3.2 生理生化实验
3.2.1 淀粉水解实验
经过48h的培养后，打开培养皿，往培养皿中滴入少量卢戈氏碘液，并使其旋转均匀后，可以观察到如下：
FX-1
FX-2 FX-3
图3-1 淀粉水解实验
表 3-2 淀粉酶实验分析
“+”表示阳性，可以水解淀粉，“—”表示阴性，不可以水解淀粉
菌种 FX-1 FX-2 FX-3
阴 / 阳性
+ + +
结论 可以水解淀粉 可以水解淀粉 可以水解淀粉
3.2.2 甲基红实验（MR）
15