国自然
ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版）第10页
1、缺血性损伤时心肌表达EPO受体改变及分布：观察缺血再灌注及心肌梗死模型中缺血区域心肌
细胞、内皮细胞及间质细胞表达EPO受体情况及随时间的改变。
2、缺血性心肌损伤时循环中EPO浓度改变及时间特征：观察缺血再灌注及心肌梗死时循环中EPO 浓度改变，随时间的浓度曲线，以及与EPO表达相关的细胞因子水平的改变。
3、外源性EPO对缺血心肌的保护作用及对EPO受体影响：观察外源性EPO对于缺血再灌注及心肌梗死的保护作用和EPO治疗开始时间及维持治疗对于保护作用的影响。观察外源性EPO对于缺血心肌表达EPO受体的影响。
研究方案：
第一部分体外培养的心肌细胞EPO受体表达及影响因素
1、新生大鼠心肌细胞原代培养，光镜及免疫细胞化学染色鉴定；
2、低氧、低糖、TNF、IL-6、EPO等单一或复合条件下培养心肌细胞，使用半定量RT-PCR，Western Blot和免疫细胞化学染色检测EPO受体表达情况。并与正常条件培养的心肌细胞对照。
3、低氧条件下培养的心肌细胞中加入不同浓度的rEPO，TUNEL法检测凋亡细胞，免疫细胞化学染色检测凋亡细胞和存活细胞表达EPO受体表达情况。
第二部分缺血损伤对于心肌细胞表达EPO受体的影响
1、钳夹3min或结扎大鼠前降支分别建立大鼠心肌缺血/再灌注和心肌梗死模型。
2、再灌注或心肌梗死即刻、2h、6h、12h、24h、4d、7d等不同时间，使用半定量RT-PCR，Western Blot和免疫组织化学染色检测EPO受体表达情况，同时以免疫组化确定细胞类型：心肌细胞（TnT、Cardiac myosin）、内皮细胞（VE-cadherin, factorⅧ）、血管平滑肌细胞（anti-a-smooth muscle myosin）及疤痕组织（1型和3型胶原抗体混合物）的特异性抗原。TUNEL法检测凋亡细胞。检测不同的时间点血浆EPO及IL-6等细胞因子浓度的变化。
3、分别在建立模型前、再灌注或心肌梗心即刻、心肌梗死后3h、6h等不同时间点开始皮下注射不同浓度的rEPO（1000-5000U/Kg，单交或1/d*7），以假手术组和生理盐水治疗组为对照。
4、不同时间获取大鼠心脏，观察心功能主要参数改变，观察梗塞区域病理变化，测定梗死面积，原位凋亡检测和EPO受体抗体双染色检测相关区域凋亡细胞数量，以及EPO受体表达的关系。
关键技术：
（1）具有心肌细胞细胞原代培养、细胞移植、基因治疗及动物体内实验等相关研究经验和技术。
（2）本校动物实验、病理检测、细胞分类鉴定、凋亡检测及其他实验条件已具备，可配合实验的完成。（3）免疫组织化学双抗体染色：可能出现两种抗体染色过程相互干扰，拟根据不同的细胞特导性抗体
和EPO抗体双染色，摸索最佳的实验方案。
申请书版本号：50456793