2.3.4 酵母转化 ..............................................................................................................25 2.3.5 G418抗性基因的去除 .........................................................................................26 2.3.6 黄酒发酵实验 ......................................................................................................26 3 结果与讨论 .....................................................................................................................28 3.1 BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响....................................................28 3.1.1 BAT1基因的验证 .................................................................................................28 3.1.2 重组质粒pUC-BABK的构建 ............................................................................28 3.1.3 BAT1基因敲除突变株的获得及验证 .................................................................30 3.1.4 BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 .............................................32 3.1.5 小结与讨论 ..........................................................................................................33 3.2 BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响...................................33 3.2.1 BAT1、BAT2基因双敲除突变株的获得及验证 ................................................33 3.2.2 突变株与出发菌株生长性能的比较 ..................................................................34 3.2.3 BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 ............................35 3.2.4 小结与讨论 ..........................................................................................................36 3.3 HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 .........................37 3.3.1 HOM2基因的验证 ...............................................................................................37 3.3.2 重组质粒pUC-HABK的构建 ............................................................................38 3.3.3 HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的获得及验证 ...................................40 3.3.4 HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 ...................41 3.3.5 遗传标记基因KanMX的去除............................................................................42 3.3.6 小结与讨论 ..........................................................................................................44 3.4 HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 .........................44 3.4.1 重组质粒pUC-HB1A1K的构建 ........................................................................44 3.4.2 HOM2基因两个等位基因敲除的突变株的获得及验证 ...................................47 3.4.3 突变株与出发菌株生长性能的比较 ..................................................................48 3.4.4 HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 ...................49 3.4.5 小结与讨论 ..........................................................................................................50 4 结 论 .............................................................................................................................51 5 展 望 .............................................................................................................................52 6 参考文献 .........................................................................................................................53 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 .................................................................................59 8 致 谢 .............................................................................................................................60
II
天津科技大学硕士学位论文
1 前 言
1.1 黄酒概述
黄酒是我国的民族特产，至今已经有6、7千年的历史，与啤酒、葡萄酒并称为世界上三大最古老的酿造酒[1]。黄酒由于具有悠久的历史、丰富的营养、独特的风味、酒精度低等特点[2]，所以受到广大人民群众的喜爱。
黄酒是以谷物为主要原料酿制成的粮食酒，它不同于白酒，黄酒是没有经过蒸馏的，酒精含量较低。黄酒是一种高营养性的饮料酒，所以又被誉为“液体蛋糕”。黄酒中富含的营养物质有氨基酸、糖、肽等，其中黄酒中的氨基酸不仅种类高达20种之多，而且其含量非常丰富，其中人体必需的8种氨基酸含量，居酿造酒之首。黄酒中还含有丰富的人体所必需的微量元素、有机酸和各种维生素[3-4]。黄酒除了直接饮用外，还可以入药，也可以入馔来去腥增香。黄酒是传统的养生保健佳品，目前的初步研究已经表明，黄酒具有抗衰老、抗氧化、降胆固醇、降血压、参与机体的代谢活动和免疫调节等功效[5-6]。黄酒是一种集饮用与保健为一体的酿造酒，是我国重点发展和扶植的饮料酒之一。
我国从实行改革开放的政策以来，黄酒行业的发展速度较快。近年来，由于国家政策的支持、黄酒企业积极引导人们消费，从而黄酒行业的发展势头良好，且行业的整体规模也稳步扩大。2006年至2010年，我国的黄酒产量由63.8万千升增加至134.1 万千升，合计增长110%，年平均复合增长率为20%。黄酒行业龙头骨干不断做大做强，发展迅速。2012年全国黄酒行业实现主营业务收入134.32亿元，同比增长12.89%；利润总额为14.49亿元，同比增长7.33%；工业销售产值136.40亿元，同比增长18.42%。2013年1-8月，全国规模以上的黄酒企业销售额同比增加8%，利润增加19%左右，较其他酒种相对稳定。但是，目前仍存在着一些问题制约着黄酒行业的快速发展，如消费市场地域性限制没有突破导致市场拓展艰难、业内存在着无序竞争从而导致黄酒价值低估身价降低、传统观念影响从而导致创新能力不够以及过分强调传统的黄酒酿造技术从而导致黄酒生产效率难以提高等。
随着人们生活水平和物质文化的日益提高，消费者对黄酒产品的品质要求也在不断的提高和变化，包括黄酒的风味口感和营养价值等，特别是消费者随着对黄酒的认识越来越高，对形成其风味的微量成分也越来越重视。传统的黄酒产品介绍与宣传已经开始制约着消费群体的进一步快速扩大，同时也制约着地域性市场的进一步拓展。如何运用研究成果来不断改进黄酒的传统酿造工艺技术，如何利用现代科学技术向生产者和消费者客观科学的介绍黄酒的风味物质，以及进一步的改善黄酒的口感和风味，达到吸引更多的消费者等，已经成为黄酒行业发展中重点研究的当务之急。
1.2 黄酒风味物质概述
黄酒独特的生产工艺赋予了其丰满、醇和、柔顺、圆润、浓郁、悠长的感觉，也
1
1 前言
赋予了其醇、香、柔、爽的独特风味[7]。黄酒这种独特的风味特征，是众多风味物质综合反应的集中体现。黄酒中的风味物质种类非常丰富，主要包括醇类、酸类、酯类、 醛类及羰基化合物等，其中酸类是黄酒中的重要呈味物质，而醇类、酯类和醛类则是黄酒香气的骨架成分，这些风味物质之间具有风味累加、相杀作用或风味协同作用，从而形成了黄酒特有的复合香[8-10]。其中，高级醇和酯类是黄酒中最重要的两类风味物质，对促进黄酒酒体丰满、浓厚，并增加酒的协调性起着重要作用。
1.2.1 高级醇对黄酒风味的影响
高级醇通常又被称为杂醇油，是指具有三个碳原子以上的一元醇类物质的总称。黄酒中的高级醇主要有正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、β-苯乙醇等[11-12]，其中含量最高的是异戊醇和异丁醇，其次是正丙醇和苯乙醇[13]。高级醇是黄酒酿造过程中不可避免的重要副产物，是构成黄酒酒体的重要成分。
高级醇的种类和含量对黄酒的口感、品质有很大的影响，黄酒中所含有的主要高级醇及其风味特征见表1-1。适宜的高级醇含量能给人以柔和、醇厚、圆润、丰满及协调的感觉。所以黄酒中的高级醇含量不宜过低或过高：若过低，酒味淡，酒体不丰满；若过高，不但造成酒体有不愉快的异杂味，还会有较强的致醉性，也就是人们俗称的“上头”[14-17]。另外，高级醇含量过高对人体有毒害作用，其毒性会随着分子量的增大而加剧。尤其是异戊醇含量过高时，由于造成人体神经系统充血，而使人产生恶心、呕吐、头疼等中毒症状。黄酒中高级醇含量仅次于异戊醇的是异丁醇，异丁醇的毒性虽然比异戊醇的毒性小，但是异丁醇含量过多也会刺激人的眼、鼻。对人体粘膜有刺激性作用的正丙醇对人体生理作用则和乙醇相近。黄酒中高级醇含量过高对人体有毒害作用这一点已经引起了消费者和生产者的高度重视，而且目前的检测数据显示，在所有酿造酒中，黄酒中高级醇的含量是最高的[18]，因此采取安全有效的解决措施，达到控制黄酒中的高级醇含量在适宜的范围内，对提高黄酒的品质和地位、以及进一步扩展黄酒市场具有重要意义。
表1-1 黄酒中主要高级醇及其显味特征
Table 1-1 Main higher alcohols in yellow rice wine and their characteristics of flavor
高级醇 正丙醇 正丁醇 异丁醇 异戊醇 苯乙醇
显味特征
刺激的酒精味，似醚臭，有苦味 较强的乙醇味和微弱的清香感 有微弱的戊醇味，有苦味感 杂醇油味，刺舌头，稍涩，有香蕉味
似玫瑰香味，微带苦涩
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天津科技大学硕士学位论文
1.2.2 酯类对黄酒风味的影响
酯类物质是黄酒中又一重要的风味物质，对黄酒的风味和品质起着关键性的作用，通常具有很强的水果味或花香味。黄酒中的酯类物质种类丰富，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸异戊酯等，其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯，占酯类物质总量的85%以上[19]。中低沸点酯类的含量是随着发酵过程的进行而不断增加的，而高级酯类则增加的非常少，高级酯大部分产生于黄酒陈酿过程中，其含量随着贮存时间而逐渐升高[7,20]。黄酒中常见的酯类及其所呈现的风味特征见表1-2，由表可知，黄酒中常见酯类对黄酒风味有着正面的作用，所以可以通过适当的提高这些有着积极作用的酯类的含量，来进一步改善黄酒的品质。
表1-2 黄酒中主要酯类及其显味特征
Table 1-2 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯类 乙酸乙酯 乳酸乙酯 辛酸乙酯 己酸乙酯 乙酸异戊酯 琥珀酸二乙酯
显味特征
香蕉、苹果香，味辣带涩，味淡 香气弱，味微苦，适量有浓厚感，多则带涩
似梨香、菠萝香，苹果味带甜
似菠萝香，味甜爽口，大曲酒香，有愉快气味
梨香，香蕉油香，苹果味 微弱并令人愉快的香气
1.2.3 其他类物质对黄酒风味的影响
黄酒中的酸是黄酒风味中重要的呈味物质，含酸量过低，味淡，酒体不协调；含酸量过高，会影响酒体的整体风味。黄酒中一些不愉快的味感部分来自于脂肪酸，所以黄酒中脂肪酸的含量以少一点为好。黄酒中的氨基酸含量丰富，赋予黄酒复杂的口感。黄酒中含糖量的多少也能够影响黄酒的品质，黄酒中含有一定量的糖能够赋予酒体醇厚感和愉快感，而含糖量过低的酒，其口感往往会比较粗糙。
1.3 黄酒发酵过程中高级醇的形成与控制 1.3.1 高级醇的形成机理
研究表明，在酿酒过程的主发酵期间，酵母菌的生长繁殖伴随着高级醇的生成，80%的高级醇是在这段时间逐渐形成的[21]，酵母生成高级醇的代谢途径有两个(图1-1)：一是分解代谢途径即Ehrlich途径，由氨基酸转氨途径生成α-酮酸[22-23]，α-酮酸经脱羧再脱氢生成高级醇；二是糖代谢途径即Harris途径，由葡萄糖经过EMP途径以及TCA循环生成α-酮酸[24-25],α-酮酸经脱羧再脱氢生成高级醇。在正常发酵液中生成的高级醇总量，75%是由糖代谢产生的，另外25%来源于Ehrlich途径[26-27]。
3
1 前言
图1-1 高级醇合成途径
Fig.1-1 Synthesis pathway of higher alcohols
1.3.1.1 分解代谢途径（Ehrlich代谢机制）
1907年，德国化学家Ehrlich[28]最早提出了由氨基酸的分解代谢形成高级醇的途径。1911年，Neubauer[29]等人对Ehrlich代谢途径进行了进一步的补充，即推断a-酮酸是高级醇代谢过程中重要的中间代谢产物，a-酮酸经脱羧转化成醛，醛再进一步还原为相应的高级醇。随后，Lampitt[30]，Yamada[31]，Thorne[32-33]，Ingraham[34]等进一步研究证实氨基酸的分解代谢生成各种高级醇。
Ehrlich代谢机制随着其后研究的不断完善，现在可归纳为：酿酒酵母在酒精发酵过程中，氨基酸通过转氨酶的转氨作用将氨基转移到α-酮戊二酸上形成谷氨酸和α-酮酸，α-酮酸在脱羧酶催化作用下，经脱羧成醛，醛再经醇脱氢酶作用下还原为相应的高级醇，反应过程如图1-2所示[35-36]。
图1-2 Ehrlich代谢途径 Fig.1-2 Ehrlich pathway
根据此反应机制，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等都可以转化为相应的高级醇。各种氨基酸与相应的高级醇之间的关系见表1-3。
表1-3 氨基酸代谢产物与其相应的高级醇
Table 1-3 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol
氨基酸 亮氨酸 异亮氨酸 缬氨酸 苏氨酸 苯丙氨酸
α-酮酸 α-异己酸 α-酮基-β-甲基戊酸 α-酮基异戊酸 α-酮基丁酸 3-苯基-2-酮基丙酸
高级醇 异戊醇 活性戊醇 异丁醇 丙醇 苯丙醇
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