天津科技大学硕士学位论文
表2-7 酶切体系
Table 2-7 Components of enzyme digestion system
组分 10×Buffer 质粒 酶 ddH2O
加样量 10 μL ≤ 2 μg 2 μL Add to 40 μL
反应条件为37℃（或30℃）水浴3~4 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。 2.3.3.4 酶切载体的去磷酸化
选用牛小肠碱性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）对酶切回收后的载体进行去磷酸化处理，如表2-8，去磷酸化体系按照60 μl标准反应体系进行。
表2-8 去磷酸化体系
Table 2-8 Components of dephosphorylation system
组分
10×Alkaline Phosphatase Buffer 质粒
CIAP（1 U/μL） ddH2O
加样量 6 μL ≤1 μg 2 μL Add to 60 μL
反应条件：先37℃水浴30 min，然后再50℃水浴30 min。
将去磷酸化后的产物按照PCR产物纯化回收的步骤进行回收，然后置于-20℃保存。
2.3.3.5 质粒载体与目的片段的连接
质粒载体与目的片段进行连接的体系见表2-9：
表2-9 连接体系
Table 2-9 Components of ligation system 组分 载体DNA 目的片段 Solution I
加样量 x μL y μL 5 μL
反应条件：载体与目的片段的摩尔比为1:3-1:10，16℃恒温条件下连接过夜。
2.3.4 酵母转化
酵母醋酸锂转化法[78-79]的主要操作步骤如下：
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2 材料与方法
（1）酵母感受态的制备
1）取斜面酵母菌种一环于5 mL YEPD液体培养基中，30℃静置培养过夜。 2）将上述过夜培养的菌液接种至装有50 mL YEPD液体培养基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振荡培养至细胞浓度为2×107个/mL（3～5 h），此时菌体处于对数期。
3）将菌液转至50 mL无菌离心管中，5000 rpm离心5 min，弃除上清液，再用25 mL无菌水洗涤两次，并弃去上清；
4）用1 mL 浓度为0.1 mol/L的LiAc缓冲液重新悬浮酵母菌体，然后转入1.5 mL的EP管中。
5）离心，弃除上清，并用0.5 ml浓度为0.1 mL的LiAc/TE缓冲液重新悬浮，每管50 μL进行分装，离心后，用移液枪小心吸除上清，并立即进行转化。
（2）转化
1）将1 mL鲑鱼精DNA煮沸5 min，并快速在冰上冷却。 2）对于每一个转化，都要小心按下列顺序加入“转化混合液”：
PEG3350（50% m/v） 240 μL 1.0 mol/L乙酸锂 36 μL ssDNA（2.0 mg/mL） 50 μL 转化片段（0.1～10 μg） 34 μL 3）剧烈振荡直到完全混匀。 4）30℃恒温箱中保温30 min。 5）42℃水浴中热激40 min。
6）13000 rpm离心30 s，去除上层转化液，然后加入1 ml YEPD重新悬浮菌体，30℃100 rpm振荡培养4 h。
7）离心去除上清液，用200～500 μL无菌水重新悬浮菌体，然后取适量菌液涂布G418抗性YEPD平板，培养2~3 d后挑取能够正常生长的转化子。
2.3.5 G418抗性基因的去除
本研究拟采用Cre-LoxP报告基因挽救系统[80-81]，来剔除报告基因KanMX。首先利用醋酸锂转化法将重组质粒pGAPza转入酵母中，然后通过半乳糖诱导后，稀释涂布于无抗性的YEPD平板。待培养出单菌落之后，将单菌落对应点接到无抗性的YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板上，置于30℃恒温条件下培养2~4 d，挑取在无抗性YEPD平板上生长而在含G418抗性平板上不生长的菌落进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，验证转化子的KanMX基因是否去除。
2.3.6 黄酒发酵实验
2.3.6.1 种子培养
（1）菌种活化：取保存于甘油管中的酵母菌转接至YEPD斜面上，30℃条件下
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培养两天。
（2）一级种子培养：取活化的斜面菌种一环，接种于装有5 mL麦汁培养基的试管中，30℃恒温箱中静置培养12 h。
（3）二级种子培养：取一级种子液2 mL接种到装有100 mL麦汁培养基的250 mL三角瓶内，30℃静置培养24 h。 2.3.6.2 黄酒发酵
将30 ml二级种子液接种到加有100 g 大米（煮熟并摊凉）、10 g麦曲、45 mL米浆水和60 mL清水的500 mL直口三角瓶内，塞上插有针孔的橡胶塞，置于30℃培养箱中发酵6 d。发酵期间每隔12 h称重一次，发酵结束后测定酒精度、残糖等基本发酵性能及高级醇的含量。
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3 结果与讨论
3 结果与讨论
3.1 BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 3.1.1 BAT1基因的验证
以提取的黄酒酵母基因组为模板，以BAT1-U和BAT1-D为引物，通过PCR扩增出基因片段，电泳结果显示PCR扩增产物较单一，特异性条带大小为1182 bp，与BATI基因大小一致，证明黄酒酵母基因组上存在完整的BAT1基因（图3-1）。
图3-1 BAT1基因的PCR产物 Fig.3-1 PCR production of BAT1 M：DL5000 DNA Marker；1：BAT1
3.1.2 重组质粒pUC-BABK的构建
3.1.2.1 目的片段的扩增
以黄酒酵母基因组为模板，利用引物BA-U和BA-D扩增BAT1基因上游的BA片段，利用引物BB-U和BB-D扩增BAT1基因下游的BB片段, 以质粒pUG6为模板，利用引物Kan-U和Kan-D扩增KanMX基因片段，电泳检测扩增片段，结果如图3-2所示。扩增出的DNA片段均与预期大小一致（BA：277 bp；BB：317 bp；KanMX：1613 bp），说明PCR扩增结果都正确。 3.1.2.2 重组质粒的构建流程
重组质粒pUC-BABK的构建流程如图3-3，将纯化的BA片段用EcoRI和BamHI进行双酶切，与经同样酶切后的pUC19质粒连接，构建重组质粒pUC-BA。将纯化后的BB片段用BamHI和PstI 进行双酶切，与经同样酶切后的pUC-BA连接，构建重组质粒pUC-BAB。将KanMX基因片段用BamHI进行单酶切，与经同样酶切并去磷酸化回收的pUC-BAB质粒连接，最终构建重组质粒pUC-BABK。
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图3-2 BA、BB和KanMX基因片段的PCR产物 Fig.3-2 PCR product of BA, BB and KanMX fragment M：DL5000 DNA Marker；1：BA；2：BB；3：KanMX
图3-3 重组质粒pUC-BABK的构建流程图 Fig.3-3 Construction of recombinant plasmid pUC-BABK
3.1.2.3 重组质粒的验证
根据重组质粒pUC-BABK的构建流程，分别将重组质粒pUC-BA、pUC-BAB和pUC-BABK进行酶切验证，电泳结果如图3-4。将重组质粒pUC-BA经EcoRI和BamHI双酶切，获得2686 bp和277 bp大小的特异性条带；将重组质粒pUC-BAB经PstI和BamHI双酶切，获得2963 bp和317 bp大小的特异性条带；将重组质粒pUC-BABK经BamHI单
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