1 前言
BAT1基因或者敲除BAT2基因时，都基本没有影响正丙醇的生成量，但敲除BAT2基因对异丁醇和异戊醇的生成量有较大的影响。Yoshimoto[63]等人的研究结果表明，BAT2基因缺失突变株发酵生成异丁醇和异戊醇的产量分别降低了72%和40%。Lilly[64]等人的研究结果表明，BAT2基因缺失突变菌株发酵生成异丁醇的含量显著下降。Nissim[65]等人构建的BAT1和BAT2基因敲除的突变株，其异丁醇的生成量显著降低，但是没有报导该突变株异戊醇的生成量及其发酵性能的变化情况。 1.4.3.2丙酮酸脱羧酶对高级醇生成量的影响
丙酮酸脱羧酶是氨基酸分解代谢途径中催化α-酮酸脱羧成醛的关键酶，Yoshimoto[66]等人构建了编码丙酮酸脱羧酶的PDC1基因缺失的突变株，其异戊醇的生成量下降了31%。Dickenson[67-69]等人研究发现，由YDL080C基因编码的类丙酮酸脱羧酶是α-酮基异己酸分解形成异戊醇的关键酶，构建YDL080C基因缺失的突变株，能够阻断或者减弱α-酮基异己酸转化形成异戊醇的途径，从而降低异戊醇的生成量。 1.4.3.3醇脱氢酶对高级醇生成量的影响
醇脱氢酶是高级醇形成途径中催化醛类还原形成高级醇的重要酶，Atsumi[70]等人指出ADH2基因编码的醇脱氢酶是催化异丁醛和异戊醛形成异丁醇和异戊醇的关键性酶，通过过量表达ADH2基因，显著提高了异丁醇和异戊醇的生成量。 1.4.3.4 天冬氨酸β-半醛脱氢酶对高级醇生成量的影响
Styger[71]等人研究指出，HOM2基因编码的天冬氨酸β-半醛脱氢酶对高级醇的生成有重要影响，构建的HOM2基因缺失菌株生成异丁醇和异戊醇的含量有显著性降低。
1.4.3.5 醇乙酰基转移酶对高级醇生成量的影响
Yoshimoto[63]等人构建的过表达ATF1的菌株，其发酵生成异戊醇和异丁醇的含量分别降低了74%和52%；Fukuda[72]等人构建的同时过表达ATF1和ATF2的菌株，不但提高了菌株乙酸酯合成酶的活力，而且还显著降低了异戊醇的生成量；本实验室张建炜[73]等人构建的过量表达ATF1的菌株，其生成异戊醇的含量下降了50%。
1.5 本课题的立题依据及研究内容 1.5.1本课题的立体依据
黄酒是我国的民族特产，深受广大人民群众的喜爱。人们的生活水平和物质文化日益提高，同时消费者对黄酒这种消费品的品质要求也在不断提高和变化，包括黄酒的风味口感和营养价值等，特别是消费者随着对黄酒的认识越来越高，对形成其风味的微量成分也越来越重视。
高级醇是黄酒的重要风味物质之一，适宜的高级醇含量及各种高级醇含量之间比例的协调可以使酒体丰满圆润，口感柔和协调；如果高级醇含量过高，不但会给酒体带来不愉快的异杂味，影响黄酒的品质，而且有较强的致醉性，危害人的身体健康。
10
天津科技大学硕士学位论文
目前的检测数据显示，在所有酿造酒中，黄酒中高级醇的含量是最高的。因此降低黄酒中高级醇含量适应健康、安全、卫生的消费趋势。
利用现代生物工程技术降低黄酒中高级醇含量是我国黄酒酿造行业重要的研究课题。许多厂家和科研机构对降低黄酒中高级醇含量进行了大量研究和探讨，主要集中在原辅料的选择和发酵工艺两个方面，但是要想从根本上提高黄酒的品质，降低生产成本，最为关键的是选育低产高级醇的优良酿酒酵母菌株。酿酒酵母生成高级醇的两条代谢途径是在众多酶的催化作用下完成的，这些酶分别是由一个或一系列相关基因编码的，为确定影响高级醇代谢途径的关键基因，本实验拟采用基因工程育种手段，敲除某些直接或间接参与高级醇代谢途径的酶的编码基因，研究基因敲除对高级醇生成量的影响。
本实验室前期实验过程中，郝欣等人构建了BAT2基因敲除突变株，该突变株进行酒精浓醪发酵实验的结果表明，突变株的基本发酵性能与出发菌株基本相同，产异丁醇和异戊醇的含量分别降低了55%和34%；戴龙海等人构建了BAT2基因敲除单倍体菌株，该突变株进行黄酒发酵实验的结果表明，突变株产异丁醇和异戊醇的含量分别降低了37%和12%左右，同时，敲除BAT2基因对黄酒酵母菌株的基本发酵性能无明显影响。以上结果显示，BAT2基因敲除对异丁醇的生成量有显著影响，对黄酒中含量最高的异戊醇的生成量影响不太显著，而对正丙醇则没有影响，本课题将继续研究高级醇代谢途径中的相关基因对高级醇生成量的影响。
本课题的目的是在探讨酿酒酵母高级醇代谢机理的基础上，研究BAT1、HOM2基因敲除以及BAT1和BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响，为理论研究提供指导。
1.5.2 本课题的主要研究内容
本课题拟从以下几个方面展开研究：
（1）BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。构建重组质粒pUC-BABK，通过醋酸锂转化法将重组片段BA-KanMX-BB导入黄酒酵母单倍体出发菌株中，筛选得到BAT1基因敲除突变株，并将BAT1基因敲除突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验，研究BAT1基因敲除对黄酒酵母单倍体菌株高级醇生成量及基本发酵性能的影响。
（2）BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。通过醋酸锂转化法将重组片段BA-KanMX-BB导入本实验室已构建好的BAT2基因敲除黄酒酵母单倍体菌株中，筛选得到BAT1、BAT2基因双敲除突变株，并将BAT1、BAT2基因双敲除突变株及其单敲除突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验，研究BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母单倍体菌株的高级醇生成量及基本发酵性能的影响。
（3）HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。构建重组质粒pUC-HABK，通过醋酸锂转化法将重组片段HA-KanMX-HB导入黄酒酵母二倍体出发菌株中，筛选得到HOM2基因一个等位基因敲除的突变株，并将HOM2基因一个等
11
1 前言
位基因敲除的突变株与二倍体出发菌株进行黄酒发酵实验，研究HOM2基因一个等位基因的敲除对黄酒酵母二倍体菌株高级醇生成量及基本发酵性能的影响。然后，利用Cre/LoxP系统去除HOM2基因一个等位基因敲除的突变株中引入的KanMX标记基因。
（4）HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。构建重组质粒pUC-HB1A1K，通过醋酸锂转化法将重组片段HA1-KanMX-HB1导入HOM2基因一个等位基因敲除的突变株中，筛选得到HOM2基因两个等位基因敲除的突变株，并将HOM2基因两个等位基因敲除的突变株与HOM2基因一个等位基因敲除的突变株及二倍体出发菌株进行黄酒发酵实验，研究HOM2基因两个等位基因的敲除对黄酒酵母二倍体菌株高级醇生成量及基本发酵性能的影响。
12
天津科技大学硕士学位论文
2 材料与方法
2.1 材料与仪器 2.1.1 主要试剂
本论文所用实验试剂如表2-1所示。
表2-1 实验试剂
Table 2-1 Reagents used in this work
试剂 葡萄糖 蛋白胨 酵母浸粉 胰蛋白胨 氯化钠 无水乙醇 G418 氨苄霉素 氢氧化钠 浓盐酸 浓硫酸 PEG3350 鲑鱼精DNA 醋酸锂 Tris平衡酚 氯仿 异戊醇 硫酸铜 次甲基蓝 酒石酸钾钠 亚铁氰化钾 丙三醇 SDS 酵母破壁酶 RNaseA 蛋白酶K
生产厂家 天津市化学试剂一厂 北京奥博星生物技术公司 北京奥博星生物技术公司 天津市化学试剂一厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市江天化工技术有限公司 北京索莱宝科技有限公司 上海生工生物有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 北京索莱宝科技有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司
13
2 材料与方法
LATaq Solution I DL5000 Marker 乙酸正戊酯 正丙醇 异丁醇 异戊醇
TaKaRa中国大连公司 TaKaRa中国大连公司 TaKaRa中国大连公司 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所
2.1.2 主要实验仪器
本论文所用实验仪器如表2-2所示。
表2-2 实验仪器
Table 2-2 Instruments and apparatuses used in this work 仪器 电热恒温水浴锅 恒温摇床 生化培养箱 电子天平 高压蒸汽灭菌锅
电热鼓风干燥箱DL102型
HS-1300-V型超净台 台式高速离心机 GL20A型高速冷冻离心机 722型光度分光光度计 pHSJ-4A型实验pH计
P型移液器
PCT-200型PCR基因扩增仪
DYY-4c型电泳仪 全自动凝胶成像仪 7890A 气象色谱仪
公司
天津市中环实验电炉有限公司 上海制成仪器制品有限公司 上海一恒科技有限公司 梅特勒-托利多仪器有限公司
山东新华医疗器械厂 天津市实验器械厂 苏州安泰空气技术有限公司
上海医用分析仪器厂 中科院生物物理所技术服务公司 天津市普瑞斯仪器有限公司 上海科学仪器有限公司 法国吉尔森公司 美国BIO-RAD公司 北京市六一仪器厂 美国SYNGENE公司 北京安捷伦科技有限公司
14