2 材料与方法
表2-4 PCR反应引物
Table 2-4 PCR primers used in this study
Primer name BAT1-U BAT1-D BA-U BA-D BB-U BB-D B-S K-S-BAT1 K-X-BAT1 B-X HOM2-U HOM2-D HA-U HA-D HB-U HB-D H-S K-S-1 K-X-1 H-X HA1-U HA1-D HB1-U HB1-D K-S-2 K-X-2 Kan-U Kan-D Zeocin-U Zeocin-D
Sequence (5′→3′)
5′- CATGTTGCAGAGACATTCCTTG-3′ 5′- CATTAGTTCAAGTCGGCAACAG-3′
5′-CCGGAATTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTG-3′ 5′-CGCGGATCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAAC -3′ 5′-CGCGGATCCGTAACTGGTCAAAAACTGTTGCCGA-3′ 5′-TGCACTGCAGCAGCGAGATACCTTGGCAACTAAAT-3′ 5′-GCATATCTGCTCAAGTAGACAAGG-3′ 5′-GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA-3′ 5′-CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC-3′ 5′-CTGTATGCCACGATGATGGAAGG-3′ 5′- TGGGTGCTACTGGTTCCGTTGGT-3′ 5′- GGCAATCAAGACACCAGAACCAGC-3′
5′-CCCAAGCTTGCAGCAGCCTTGCCCTTTTACAC-3′ 5′-CGCGGATCC ACCAACGGAACCAGTAGCACCCA -3′ 5′-CGCGGATCC GGTTCTGGTGTCTTGATTGCCGAAATC-3′ 5′-CGGGGTACCACAGTGCTATTGTGAGTGTATCCCAGC-3′ 5′-GCTAAACACGCCTGTGGTCATTC-3′ 5′-CGGATAAAATGCTTGATGGTCGGA-3′ 5′-CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGT-3′ 5′-GGAAGGCACTACTGAGCCAAATG-3′
5′-CCCAAGCTTGCTGGTGTTTTGGGTGCTACTG-3′ 5′-CGCGGATCCCGATAGCGCCAGCATAGTCAGC -3′ 5′-CGCGGATCCCAAGAACAGACCTGCTCCATCC -3′ 5′-CCGGAATTCATCAAGACACCAGAACCAGCGG-3′ 5′-GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA-3′ 5′-CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC-3′ 5′-CGCGGATCCCAGCTGAAGC TTCGTACGC-3′ 5′-CGCGGATCCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3′ 5′-ATCGTCGACCCCACACACCATAGCTTCA-3′ 5′-GCGGTCGACAGCTTGCAAATTAAAGCCTT-3′
Restriction
site None None EcoRI BamHI BamHI PstI None None None None None None Hind III BamHI BamHI KpnI None None None None Hind III BamHI BamHI EcoRI None None BamHI BamHI None None
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2.3.2 各目的基因片段的获得
2.3.2.1 酵母基因组DNA的提取
采用solarbio酵母基因组DNA提取试剂盒提取。其操作步骤如下:
（1）取斜面酵母菌种一环于装有5 mL YEPD液体培养基的试管中，30℃静置培养过夜。
（2）取适量酵母菌液（不超过5×107 cells）于1.5 mL EP管中，12000 rpm离心1 min，尽量去除上清；向菌体中加入470 μL山梨醇Buffer，充分悬浮酵母菌体，再加入25 μL酵母破壁酶及5 μL β-巯基乙醇，上下颠倒充分混匀，30℃温度下放置1~2 h。
（3）12000 rpm离心1 min，弃除上清，并收集沉淀。
（4）向上述沉淀中加入200 μL溶液A，并用枪头吹吸以充分悬浮沉淀，然后向悬浮液中加入20 μL（10 mg/mL）的RNaseA，并充分颠倒混匀，于室温放置10 min。
（5）然后加入20 μL（10 mg/mL）的蛋白酶K，并充分颠倒混匀，在65℃水浴中消化15~30min，消化期间可以颠倒混匀数次，直到样品完全消化为止。
（6）消化完全后加入200 μL溶液B，200 μL无水乙醇，并充分地颠倒混匀，这时可能有絮状沉淀产生，并不影响DNA的提取（可以将溶液与絮状沉淀都加入到吸附柱中，然后室温放置2 min，最好能充分混匀以减少沉淀）。
（7）12000 rpm离心2 min，弃掉废液，然后将吸附柱重新放入收集管中。 （8）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液（在使用之前应先检查是否已经加入无水乙醇），12000 rpm离心1 min，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（9）向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 rpm离心1 min，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（10）12000 rpm离心2 min，将吸附柱敞口放置于室温或50℃温箱数分钟，其目的是将吸附柱中残留的漂洗液除去，否则残留漂洗液中的乙醇会影响到后续的实验，如酶切、PCR等。
（11）将吸附柱放于干净的1.5 mL EP管中，然后向吸附膜中央悬空滴加50~200 μL预先经过65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5 min，12000 rpm离心2 min。
（12）将上述离心所得洗脱液再重新加入到吸附柱中，室温静置5 min，12000 rpm离心2 min，即得到高质量的基因组DNA。 2.3.2.2 各基因片段的PCR扩增
（1）PCR反应体系加样量如表2-5。
21
2 材料与方法
表2-5 PCR反应体系 Table 2-5 PCR reaction system
成分
10×LA Taq Buffer dNTPs (2.5 mmol/L)
加样量 2 μL 1.5 μL
上游引物(10 μmol/L) 1 μL 下游引物(10 μmol/L) 1 μL 模板 LATaq酶 ddH2O
质粒0.5 μL/基因组1 μL 0.5 μL Add to 20 μL
（2）PCR反应条件见表2-6。
表2-6 PCR反应条件
Table 2-6 Reaction conditions of PCR
步骤 预变性 变性 退火 延伸 终延伸
温度 95℃ 94℃ X℃ 72℃ 72℃
时间 5 min 40 s 1 min 1-3 min 10 min
注：X与引物有关，一般比其Tm值小5 ℃~10 ℃
变性至延伸部分共循环30次，退火温度X由各目的基因片段的引物情况决定。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。 2.3.2.3 琼脂糖凝胶电泳
（1）根据所需要的浓度（0.8%~1.5%）称取一定量的琼脂糖，然后加入一定量的1×TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热使琼脂糖完全溶解。
（2）将完全溶解的琼脂糖倒入制胶模具，一般使凝胶厚度在0.3~0.5 cm，然后迅速地在模具一端插上梳子，并检查有无气泡。
（3）室温条件下放置30~45 min，直到琼脂糖溶液完全凝固，小心地拔出梳子后，将凝胶放置于电泳槽中。
（4）向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液并使其液面高出胶面1 mm左右。 （5）取一定量的DNA样品与适量的6×上样缓冲液混合均匀，然后用移液枪加入到样品孔中。
（6）接通电泳槽与电泳仪的电源，然后将电压降选择1~5 V/cm。
（7）根据上样缓冲液迁移的位置判断是否终止电泳，切断电源，取出凝胶后放
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于EB溶液中，浸泡时间约为10 min；
（8）从EB溶液中取出凝胶后放入凝胶成像系统中检测电泳结果，并保存电泳图片。
2.3.2.4 PCR产物纯化回收
采用OMEGA公司的DNA Back纯化回收试剂盒进行PCR、酶切反应后的纯化回收。
（1）将需要纯化的PCR产物或酶切产物转移至1.5 mL EP管中，每管含量应小于15 μg。
（2）然后向EP管中加入4～5倍体积的Buffer CP，用移液枪充分吹吸混匀后，再将其转移到蓝色的回收柱中。
（3）12000 rpm离心1 min后，倒掉收集管中的废液。
（4）向离心管中加入700 μL DNA Wash Buffer，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，此操作重复两次。
（5）13000 rpm空甩2 min后，弃掉收集管。
（6）将吸附柱开盖敞于室温放置20 min左右，去除残留乙醇。
（7）将吸附柱置于新的离心管中，加入20～100μL洗脱液，静置2 min。 （8）12000 rpm离心1 min，离心管内的溶液即为纯化的DNA溶液，-20℃保存
2.3.3 重组质粒的构建
2.3.3.1 大肠杆菌感受态的制备及转化
（1）感受态细胞的制备
采用TAKARA的Competent Cell Preparation Kit制备大肠杆菌感受态细胞，具体步骤如下：
1）取-70℃保存的大肠杆菌DH5α在LB平板上划线，37℃过夜培养。 2）挑接单菌落于含有5 mL LB液体培养基的试管中，于37℃，200 rpm摇床中培养过夜。
3）将上述培养菌液按1%的比例转接至装有200 mL新鲜LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃，220 rpm培养3h左右，至菌体的OD600为0.4-0.6。
4）将菌液立即放置于冰上预冷10 min，4℃，5000 rpm离心5 min，弃除上清，收集大肠杆菌的菌体沉淀。
5）然后向大肠杆菌菌体沉淀中加入20 mL冰浴的Solution A，轻轻晃动以悬浮菌体沉淀，禁止剧烈振荡。
6）4℃，4000 rpm离心5 min，然后尽量去除上清液。
7）向菌体沉淀中加入40 mL冰浴的 Solution B，轻轻晃动以悬浮菌体沉淀，禁止剧烈振荡浮。
8）用灭菌的1.5 mL EP管分装，100 μL/管。放置于-70℃冰箱保存备用。
23
2 材料与方法
（2）转化
1）从-70℃冰箱中取出感受态细胞，并置于冰浴融化。 2）加入连接产物10 μL，轻轻混匀，冰浴30 min。
3）冰浴后42℃热激90 s，并迅速转移至冰浴中，继续冰浴2 min。 4）加入适量的经37℃预热的LB液体培养基，37℃，220 rpm振荡培养1 h， 5）取适量菌液涂布含Amp+抗性的LB平板，37℃培养箱中倒置过夜。 6）挑取阳性转化子培养，提取质粒，然后进行酶切和电泳验证。 2.3.3.2 质粒提取
（1）粗提
1）从LB平板上挑取单菌落于装有LB液体培养基的试管中，37℃，200 rpm过夜培养。
2）取适量菌液到1.5 mL的EP管中，12000 rpm离心1 min。 3）弃除上清，剩余大约50 μL液体，用移液枪吹打混匀菌体。 4）向其中加入50 μL的酚氯仿溶液，并用涡旋振荡器充分混匀。 5）12000 rpm离心5 min以上，取其上清，进行电泳验证。 （2）采用solarbio质粒小提试剂盒精提。
1）取适量菌液到1.5 mL的EP管中，12000 rpm离心1 min，尽量去除上清。 2）向留有菌体沉淀的EP管中加入250 μL溶液I，并用移液枪充分悬浮菌体沉淀。 3）向EP管中加入250 μL溶液II，并温和地上下翻转6～8次，从而使菌体充分裂解。 4）向EP管中加入350 μL溶液III，并马上温和地上下翻转6～8次以充分混匀，此时将会出现白色絮状沉淀，然后12000 rpm离心10 min。
5）将上一步离心得到的上清液转入吸附柱中，并在室温下放置2 min，12000 rpm离心1 min之后，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱重新放进收集管中。
6）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液之后，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱重新放进收集管中。
7）再向吸附柱中加入500 μL的漂洗液，然后12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱重新放进收集管中。
8）12000 rpm空甩2 min，丢掉收集管，并将吸附柱敞口放置于室温下数分钟。 9） 将吸附柱置于新的离心管中，并向吸附膜中央悬空滴加50～200 μL经65℃水浴预热的洗脱液，于室温下放置5 min，然后12000 rpm离心1 min。
10）为了增加质粒的回收率，可以将上步离心得到的洗脱液重新滴加到吸附柱中，并在室温下放置5 min，12000 rpm离心1 min。
11）离心管中的液体即为提取的质粒，-20℃保存备用。 2.3.3.3 质粒载体和目的片段的酶切
质粒和目的片段的酶切体系如表2-7：
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