天津科技大学硕士学位论文
图3-9 突变株与出发菌株生长曲线的比较 Fig.3-9 Growth curve of mutant strains and parent strains
3.2.3 BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响
3.2.3.1 突变株与出发菌株基本发酵性能的比较
将BAT1、BAT2基因双敲除突变株RY1-a1-?bat1?bat2、RY1-α3-?bat1?bat2与单敲除突变株RY1-a1-?bat1、 RY1-α3-?bat1 、RY1-a1-?bat2、RY1-α3-?bat2及其出发菌株同时进行黄酒发酵实验，发酵过程中记录CO2失重、发酵结束后测量发酵液中的还原糖含量，蒸馏黄酒发酵液并测量其酒精含量，结果见表3-3所示。
表3-3 突变株与出发菌株基本发酵性能比较
Table 3-3 Basic fermentation performances of mutant strains and parent strains 菌株
CO2累计失重
（g）
RY1-a1 RY1-α3 RY1-a1-?bat1 RY1-α3-?bat1 RY1-a1-?bat2 RY1-α3-?bat2 RY1-a1-?bat1?bat2 RY1-α3-?bat1?bat2
30.1 30.0 30.1 30.2 30.3 30.2 27.5 27.2
酒度 （%，v/v）
14.1 14.0 13.9 14.1 14.2 14.0 12.7 12.5
残糖 （g/100 mL）
0.95 0.83 0.91 0.77 0.72 0.85 0.79 0.82
由表中可以看出，与出发菌株RY1-a1、RY1-α3相比，单敲除突变株RY1-a1-?bat1、 RY1-α3-?bat1 、RY1-a1-?bat2 、RY1-α3-?bat2的基本发酵性能没有发生明显变化；双敲除突变株RY1-a1-?bat1?bat2、RY1-α3-?bat1?bat2的CO2累计失重分别是27.5 g和27.2 g，较其出发菌株RY1-a1、RY1-α3分别下降了2.6 g和2.8 g，发酵液蒸馏后的
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3 结果与讨论
酒度分别是12.7度和12.5度，较出发菌株RY1-a1、RY1-α3分别下降了1.4度和1.5度，发酵液中残糖含量则均低于1 g/100mL。发酵结果表明，BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母单倍体菌株的发酵速度及产酒率产生了显著的影响。 3.2.3.2 突变株与出发菌株高级醇生成量的比较
BAT1、BAT2基因双敲除突变株RY1-a1-?bat1?bat2、RY1-α3-?bat1?bat2与单敲除突变株RY1-a1-?bat1、 RY1-α3-?bat1 、RY1-a1-?bat2、RY1-α3-?bat2及其出发菌株黄酒发酵结束后，取发酵液的蒸馏液进行气相色谱分析，检测突变株与出发菌株发酵产高级醇的含量，结果见表3-4。
表3-4 突变株与出发菌株高级醇生成量的比较
Table 3-4 Higher alcohols production of mutant strains and parent strains 菌株
正丙醇 （mg/L）
RY1-a1 RY1-α3 RY1-a1-?bat1 RY1-α3-?bat1 RY1-a1-?bat2 RY1-α3-?bat2 RY1-a1-?bat1?bat2 RY1-α3-?bat1?bat2
100.15 98.49 96.78 101.12 101.44 97.89 87.77 90.07
异丁醇 （mg/L） 157.24 152.39 156.68 150.85 96.73 100.08 72.35 75.69
异戊醇 （mg/L） 351.73 347.14 352.51 346.13 308.02 311.22 258.82 263.12
从表中可以看出，BAT1、BAT2基因双敲除突变株RY1-a1-?bat1?bat2产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为87.77 mg/L、72.35 mg/L和258.82 mg/L，较出发菌株RY1-a1分别降低了12.36%、53.99%、26.42%，较突变株RY1-a1-?bat1分别降低了9.31%、53.82%、26.58%，较突变株RY1-a1-?bat2分别降低了13.48%、25.04%、15.97%；BAT1、BAT2基因双敲除突变株RY1-α3-?bat1?bat2产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为90.07 mg/L、75.69 mg/L和263.12 mg/L，较出发菌株RY1-α3分别降低了8.55%、50.33%、24.20%，较突变株RY1-α3-?bat1分别降低了10.93%、49.82%、23.98%，较突变株RY1-α3-?bat2分别降低了7.99%、24.37%、15.46%。结果说明，BAT1、BAT2基因双敲除能够显著降低黄酒酵母单倍体菌株生成高级醇的含量。
3.2.4 小结与讨论
BAT1、BAT2基因双敲除突变株与其单敲除突变株及出发菌株的发酵结果表明，单敲除BAT1或BAT2基因时，黄酒酵母的生长繁殖没有受到明显影响，黄酒发酵时CO2的总失重及产酒率基本保持不变；但是当双敲除BAT1和BAT2基因时，黄酒酵母的生长繁殖受到了抑制，进行黄酒发酵时，其CO2的总失重和产酒率明显降低，说
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明BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母的基本发酵性能产生了明显的影响。同时气相色谱检测结果显示，BAT1、BAT2基因双敲除突变株发酵产高级醇的含量较BAT1单敲除突变株和出发菌株显著降低，较BAT2单敲除突变株产高级醇的含量也有明显降低。本实验所得结论再次证明了Schoondermark-Stolk等人[82]的研究结果，即在含有葡萄糖的培养基中，BAT1、BAT2基因双敲除会抑制酿酒酵母的生长及降低高级醇的生成量。
在黄酒发酵过程中，氨基酸分解代谢途径是高级醇生成的一个重要途径，氨基酸分解代谢途径中，由BAT1和BAT2基因编码的转氨酶的缺失可以阻断或减弱氨基酸转变成α-酮酸的量，进而可以减少缬氨酸生成异丁醇和亮氨酸生成异戊醇的量。因此，BAT1、BAT2基因双敲除后，严重阻断了氨基酸的分解和合成代谢，因而严重影响了酵母的生长繁殖和代谢，造成高级醇生成量的降低。所以，BAT1、BAT2基因双敲除突变株黄酒发酵生成高级醇含量的严重降低一部分原因是因为支链氨基酸转氨酶的全部缺失严重降低了α-酮酸中间体的生成，可能还有另一个原因是由于菌体自身代谢减弱造成的。
3.3 HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 3.3.1 HOM2基因的验证
以提取的黄酒酵母基因组为模板，以HOM2-U和HOM2-D为引物，通过PCR扩扩增得到1040 bp大小的部分HOM2基因片段，电泳结果显示PCR扩增产物较单一，特异性条带大小与预期大小一致，证明黄酒酵母基因组上存在完整的HOM2基因（图3-10）。
图3-10 HOM2基因的PCR产物 Fig.3-10 PCR production of HOM2 M：DL5000 DNA Marker；1：HOM2
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3 结果与讨论
3.3.2 重组质粒pUC-HABK的构建
3.3.2.1 目的片段的扩增
以黄酒酵母RY1的基因组为模板，利用一对引物HA-U和HA-D扩增HOM2基因上游的HA片段，利用引物HB-U和HB-D扩增HOM2基因下游的HB片段, 以质粒pUG6为模板，以一对引物Kan-U和Kan-D扩增1613 bp的KanMX抗性基因片段，电泳检测扩增片段，结果如图3-11所示。扩增出的DNA片段均与预期大小一致（HA：461 bp；HB：431 bp；KanMX：1613 bp），说明PCR扩增结果都正确。
图3-11 HA、HB和KanMX基因片段的PCR产物 Fig.3-11 PCR product of HA, HB and KanMX fragment M：DL5000 DNA Marker；1：HA；2：HB；3：KanMX
3.3.2.2 重组质粒的构建流程
重组质粒pUC-HABK的构建流程如图3-12，将纯化的HA片段用HindIII和BamHI进行双酶切，与经同样酶切后的pUC19质粒连接，构建重组质粒pUC-HA。将纯化后的HB片段用BamHI和KpnI进行双酶切，与经同样酶切后的pUC-HA连接，构建重组质粒pUC-HAB。将KanMX基因片段用BamHI进行单酶切，与经同样酶切并去磷酸化回收的pUC-HAB质粒连接，最终构建重组质粒pUC-HABK。 3.3.2.3 重组质粒的验证
根据重组质粒pUC-HABK的构建流程,分别将重组质粒pUC-HA、pUC-HAB和pUC-HABK进行酶切验证，电泳检测目的片段，结果如图3-13。将重组质粒pUC-HA经HindIII和BamHI双酶切，获得2686 bp和461 bp大小的特异性条带；将重组质粒pUC-HAB经BamHI和KpnI双酶切，获得3147 bp和431 bp大小的特异性条带；将重组质粒pUC-HABK经BamHI单酶切，获得3578 bp和1613 bp大小的特异性条带，这些片段大小均与预期结果一致，基本证明重组质粒构建成功，然后将质粒送往测序公司进行基因测序，结果证明重组质粒构建正确，其中KanMX与HA和HB连接方向相同。
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图3-12 重组质粒pUC-HABK的构建流程图 Fig.3-12 Construction of recombinant plasmid pUC-HABK
图3-13 重组质粒pUC-HA、pUC-HAB和pUC-HABK的酶切验证
Fig.3-13 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmids pUC-HA, pUC-HAB and
pUC-HABK
M：DL5000 DNA marker；1：pUC-HA/HindIII-BamHI；2：pUC-HAB/KpnI-BamHI；
3：pUC-HABK/BamHI
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