阻碍RNA聚合酶与启动子结合及滑动，于是，转录终止，与乳糖代谢有关的三种酶基因不表达。
2. 周围环境有乳糖时：乳糖代谢产物半乳糖，能与阻遏蛋白结合，于是阻遏蛋白分子构象改变，随之与O序列分离，结果，RNA聚合酶能与P序列结合，并滑向结构基因，转录开放，表达出与乳糖代谢有关的三种酶，对乳糖进行利用代谢。
13、真核基因有哪些特点？ 答：（一）真核基因组远大于原核基因组
（二）真核哺乳类基因组中，编码蛋白质及功能RNA（rRNA、tRNA等）的序列只占总基因组的10%，其余90%基因结构序列中，包含有大量重复序列，功能至今还不十分清楚。
（三）真核生物编码蛋白质的基因是不连续的，由一些内含子间隔，故称为断裂基因
（四）真核生物一个结构基因只转录生成一条mRNA（单顺反子），它包含一种蛋白质的编码信息。即使蛋白质四级结构中的不同亚基，都是由不同的基因表达。（原核结构基因转录生成的一条mRNA ，称多顺反子，它包含了几种功能相关蛋白质的编码信息）
（五）真核基因在细胞核内与多种蛋白质结合构成染色质，染色质的结构状况也直接影响着基因表达。
（六）真核生物基因信息不仅存在核DNA上，还存在线粒体DNA（mtDNA）上。 14、染色质如何参与基因表达调控？ 答：（一）染色质结构致密，不易转录，染色质结构松弛，容易转录。在缺乏核小体结构的“裸露”DNA链，特别容易转录，称之为转录超敏位点（hypersensitire site） （二）组蛋白修饰调节
1. 乙酰化修饰：组蛋白（主要是H3、H4）乙酰化修饰，使染色质由紧密变得松弛，有利于转录。
2. 甲基化修饰：组蛋白（主要是H3、H4）甲基化，使组蛋白与DNA亲和力增加，染色质变得紧密，不易转录。反之，去甲基化，则有利于转录 3. 磷酸化修饰：组蛋白磷酸化修饰能激活基因转录过程。 15、什么是反式作用蛋白调控？
答：反式作用蛋白特异地结合在相应的顺式作用元件，通过DNA-蛋白质相互作用调节基因表达的强弱，称反式调节作用，包括反式激活作用及反式抑制作用。编码反式作用蛋白的基因位于远离被调控基因的同一条DNA链上或位于另一条DNA链上。反式作用蛋白调控是真核基因表达调控最基本最主要的方式。 16、什么是顺式作用蛋白调控？ 答：基因表达的某些蛋白产物，能特异识别结合这个基因自身的顺式作用元件（调控序列），从而调节该基因的表达，称之为顺式调节作用。这个具调节作用的蛋白质称为顺式作用蛋白
17、什么是通用转录因子？什么是特异转录因子？
答：通用转录因子（general transcription factor）:这类蛋白质因子帮助RNApol与启动子结合，并起始转录过程，它们的作用对所有基因的转录都是必需的。它们的存在没有组织特异性，因此，对基因表达的时间特异性及空间特异性并不重要。如TF ⅡD、TF ⅡH等。
特异转录因子（special transcriprion factor）：这类转录因子是个别基因转录所必需的，它决定该基因表达的时间特异性及空间特异性。这类转录因子有的起转录激活作用，有的起转录抑制作用，分别称为转录激活因子及转录抑制因子。转录激活因子常常是一些增强子结合蛋白。转录抑制因子多数是沉默子结合蛋白。
18、转录因子的DNA结合结构域有哪些？简述之。
答：(1) 锌指模体结构(p372)：是一种蛋白质空间结构，外形似手指。它含有23个AA残基，形成一个α-螺旋及两个反向平行β折叠。 α-螺旋上有二个组氨酸残基。每个β-折叠上各有一个半胱氨酸残基。这四个氨基酸残基这四个AA残基通过配位键与锌离子相连，就形成了外形似指 的结构。它插入DNA双螺旋大沟，从而实现转录因子与DNA的结合
(2) 碱性螺旋-环-螺旋模体结构（bHLH ）：它至少含有二个α-螺旋及一小段短肽形成的环所组成，其中一个α-螺旋富含碱性氨基酸而显碱性，容易与带负电的DNA结合。
(3) 碱性亮氨酸拉链（bZIP）模体结构：在其肽链C-末端的AA序列中，每隔六个AA残基出现一个亮氨酸残基（疏水性），这段肽形成α-螺旋时，亮氨酸有规律的出现在α-螺旋的一侧。二个这种结构通过亮氨酸之间的疏水作用结合成的二聚体，外形如同拉链。这个二聚体的N-末端富含碱性氨基酸，而显正电，容易与带负电的DNA结合。
19、mRNA稳定性受哪些因素的影响？
答：1. mRNA 5‘端帽结构对mRNA稳定性的影响
mRNA 5‘端帽结构能增加mRNA稳定性，促进转录，其原因是： (1) 帽结构可对抗细胞内 5‘-核酸外切酶 对mRNA 的降解作用 (2) 帽结构与帽结合蛋白结合，提高翻译效率
(3)帽结构促进mRNA从细胞核进入细胞质，便于起模板作用
2. mRNA 3‘端 polyA尾对mRNA 稳定性的影响： 尾结构增加mRNA 稳定性，促进转录，其原因是： (1) polyA尾结构能防止3‘-核酸外切酶对mRNA的降解 (2) polyA尾结构参与翻译的起始过程 (3) 促进mRNA从细胞核转入细胞质
(4) mRNA 3‘ 端常形成发夹式结构，能防止核酸酶攻击（水解）
(5) mRNA 3‘端若是富含AU序列（ARE，AU –rich sequence), 能促进使核酸酶切除 polyA, 使mRNA降解，因此，3‘ 端含有ARE 区的mRNA通常都不稳定。 20、非编码小分子RNA主要有哪些？它们的作用是什么？ 答：有siRNA (干扰小RNA ，small interfering RNA)、mi RNA (微小RNA，micro RNA)、核酶、snRNA (细胞核小分子 RNA)等；它们都能抑制 mRNA，产生转录后 基因沉默。
21、eIF—2α磷酸化对翻译有何影响？举例说明之。eIF—4E磷酸化对翻译有何影响？ 答：1. eIF-2α磷酸化可抑制翻译的起始，抑制翻译起始复合物的形成。如干扰素的作用机理是 dsRNA可激活蛋白激酶，进而促使eIF-2α磷酸化，从而抑制蛋白质合成的起始；又如血红素能促进珠蛋白合成是由于它能抑制蛋白质激活酶活性，使eIF-2 α磷酸化水平降低。
2. eIF-4E 及 eIF-4E结合蛋白 的磷酸化能激活翻译的起始，促进翻译起始复
合物的形成，增强翻译过程。如生长因子能增加eIF-4E磷酸化，于是翻译加快，促进细胞生长
22、举例说明RNA结合蛋白对翻译过程的调节？
答：RNA结合蛋白（RBP，RNA birding protein）能与 RNA 特异序列结合，从而参与调节翻译过程。如铁反应元件结合蛋白（IRE-BP）（IRE: Iron response element,铁反应元件）与mRNA结合后，能促进ALA合成酶的合成等。 23、miRNA对基因表达有何影响？miRNA的特点有哪些？
答：miRNA（micro-RNA，微小RNA）属于小分子非编码 RNA，长度约20个碱基，它与一些蛋白质共同组成 RNA诱导沉默复合体 RISC（RNA-induced silencing complex）,它能与mRNA结合，从而抑制 mRNA的翻译功能。 miRNA的特点：
(1) 长度为20-25个碱基。
(2) 在不同生物中普遍存在，昆虫、家鼠、人类乃至植物中均含有。 (3) 同一种类生物体内，其序列结构具有一定的保守性，但动植物之间其序列结构不存在一致性。
(4) miRNA 的表达具有明显时间特异性及空间特异性。
(5) miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇形式存在于非编码区，它具有高度多样性。
24、siRNA 对基因表达有何影响？什么是RNAi？
答：siRNA：干扰小RNA是由细胞内的一类双链RNA（dsRNA, double-stranded RNA），在特定条件下，由相应酶的酶切作用，产生了特殊序列的小片段dsRNA，长度约21-23碱基，称之为siRNA。这种双链 siRNA参与组成RISC，并能与特异的靶 mRNA互扑结合，导致mRNA降解，阻断翻译过程。这种由 siRNA介导的抑制基因表达的作用，称之为RNA干扰（RNAi，RNA inlerference）， 它被广泛用于基因功能研究及基因治疗。
第二十章 常用分子生物学技术的原理及应用
1、什么是核酸分子杂交？
答：核酸分子杂交：根据核酸单链片段之间碱基互补而相结合的原理，用一已知碱基顺序的DNA或RNA单链片段作为探针来检测未知待测DNA或RNA中的核苷酸顺序。若对探针进行标记，根据有无标记信号而确定有无杂交体存在。又根据探针的碱基顺序，按碱基配对规则就可以测定待测DNA或RNA的碱基顺序。 2、什么是核酸探针？核酸探针的来源有哪些？探针的标记方法有哪些？ 答：（1）核酸探针:核酸探针是一已知碱基顺序的DNA或 RNA单链片段，它能与待测 DNA或RNA 按碱基配对规则进行杂交反应。为了便于观察是否发生杂交反应以及杂交反应的位置及强弱，必须对探针进行标记，从而确定待测核酸（基因）是否存在，进而确定待测核酸的碱基顺序。 (2) 核酸探针的来源
① 人工合成：用核酸合成仪按预定目标合成一已知碱基顺序的寡核苷酸片段，常用的是DNA片段。
② 从基因组获得：用 PCR法扩增基因组中的某个基因片段。
③ cDNA探针：从真核细胞液中提取mRNA，经逆转录得到CDNA, 用cDNA全长或其部分片段作为探针。
④ RNA探针：由于RNA不太稳定，常较少用。 (3) 探针标记
① 放射性核素标记：用放射性同位素标记探针，检测标记信号，采用放射性自显影法。
② 荧光染料标记：用荧光染料物质（如溴乙锭等）标记探针，检测标记信号：能直接看到荧光 或采用特殊仪器收集荧光信号信息（如基因芯片用激光共聚集扫描收集荧光信号）。
③ 生物素标记探针：用生物素标记探针。检测标记信号：生物素分子上连接有特定的酶，加入相应底物后，通过特定酶催化反应过程，产生具有一定有色的物质。
3、什么是Southern印迹？有何应用？简述Southern blotting 的基本过程原理？
答：DNA印迹（DNA blotting）也称southern blotting,是 E.Southern 最先发明使用于检测DNA，顾称之。 其具体过程原理是：
(1) 将待测DNA用限制性核酸内切酶酶切水解得到大小不同的DNA片段。 (2) 将这些片段进行琼脂糖凝胶电泳，大小不同DNA片段停留在凝胶板上的不同位置形成不同的区带。
(3) 将含不同DNA片段的凝胶板放到DNA变性溶液（如0.5mol/L NaOH等）中进行变性处理，使双DNA成为单链DNA
(4) 将凝胶板上的变性DNA转移到硝酸纤维膜（NC膜 ，Nitrocellulose）上：用多量吸水纸吸附的毛细管作用，使凝胶板上DNA转移至NC膜上，由于NC膜具有很强的吸附DNA的作用，一旦胶板上DNA转移到NC膜上时，就能牢固的吸附在膜上，并保持原来位置不发生变化。
(5) 将转移后的NC膜经80℃真空加热或紫外交联仪处理，DNA就能非常牢固的固定在NC膜上，便于进行杂交。
(6) 杂交反应：将标记的探针与NC膜进行杂交，68℃杂交12小时。 (7)杂交信息监测：放射自显影或荧光信号监测确定有无杂交体、杂交体的位置及强弱。 应用：根据探针的碱基顺序确定目的基因的碱基顺序，对相关基因进行定性分析，还能进行定量析，以及对重组质粒进行分析等。
4、什么是Northern印迹？有何应用？Northern印迹与Southern印迹有何异同？
答：RNA印迹（RNA blotting）也称Northern Blotting，其基本过程及原理与Southern blotting 相同，只是监测对象由 DNA换成 RNA。由于被检测RNA分子较小，常无需限制性内切酶来酶切。电泳RNA转移至NC膜上以及杂交信息的检测，都与Southern blotting 相同。由于RNA极不稳定，易受RNA酶降解，因此实验过程中要加入RNA酶 抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯，diethlpyrocarbonate)
应用:主要用于RNA定量分析
(1) 检测组织细胞中某一已知的特异 mRNA的表达水平 (2) 比较不同组织细胞中同一基因（ mRNA ）的表达情况
5、什么是Western印迹？有何应用？Western印迹的基本过程原理是什么？ 答：蛋白质印迹常称为Western blotting（与Southern blotting, Northern blotting 相对应）。由于检测蛋白质不是用探针，而是用该蛋白质特异的相应抗
体。因此，也称免疫印迹（immoublotting）。 1. 实验原理：
（1）将混合组分蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将各组分逐一分开停留在凝胶的不同区带
（2）通过转移电泳方法（与DNA，RNA转移方法不同）将凝胶板上的各组分蛋白质转移至NC膜上。
（3）用被检蛋白质相应的特异性抗体（称第一抗体）与NC膜上的各组分蛋白质进行免疫反应。于是，特异性抗体就与NC膜上相应的特异性蛋白质结合成抗原—抗体复合物。
（4）用与第一抗体相对应的特异性第二抗体，将它进行碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记。将这种标记的第二抗体与第一抗体—抗原复合物反应。于是标记了的第二抗体就与第一抗体进行特异性的结合。形成了三种物质的三元复合物。 （5）印迹信号的检测： ① 显色检测：加入相应的底物，在碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的作用下，使底物反应产生具有一定颜色的物质。
② 放射性自显影检测：用于放射性核素标记信号的检测。 2.应用： （1）蛋白质特别是微量蛋白质的定性检测：一复合物组分蛋白质中含有微量的目的蛋白质时，可用Western blotting 进行定性检测。
（2）特异蛋白质的半定量分析：特异蛋白质经蛋白质印迹质显色后，与标准量蛋白质比较，经扫描方法可进行半定量测定。
6、什么是斑点印迹（DNA点杂交）？什么是细胞原位杂交？
答：斑点印迹（dot blotting）:将待测DNA或RNA，不需经电泳分离直接点样在NC膜使之呈点状。再用标记的已知碱基顺序的探针与之杂交。如出现阳性杂交体，根据探针的碱基顺序，按碱基配对规则就可确定待测DNA或RNA的存在以及它们的含量。
细胞原位杂交（ISH，in situ hybridigation）：用组织切片或细胞涂片或细胞印片，对其进行一定处理，使细胞膜通透性增加，用标记的探针与之杂交，在细胞DNA原位置处形成杂交体。常用于肿瘤的基因诊断。 7、什么是PCR？基本原理是什么？
答：PCR (polymerase chain reaction) 称聚合酶链反应，是由美国生化学 Mullis 于1983年创建的方法。使一个基因片段在试管内经 2-3小时反应后，其拷贝数可增加至百万倍以上，不需要经复杂的分子克隆技术就可得到基因片段的大量拷贝，使得过去很多不能进行的分子生物学实验得以顺利进行。 PCR的基本原理
利用DNA半保留复制的原理结合体外DNA在不同温度下变性、复性的原理建立了高温变性、低温复性、适温（称延伸温度）下合成链延伸的三步连续反 应的不断循环：
1，高温变性：94℃左右时，双链DNA中两条单链之间氢键断裂，解开成两条单链，便于起模板作用，但又不影响3’，5’-磷酸二酯键的稳定性。此温度时，单链DNA引物自身间的聚合也完全解开，引物便于充分发挥作用。 2. 低温复性，便于DNA单链引物与单链模板DNA之间的结合：在55℃左右时，一对（两条）小DNA单链引物中，一条引物与一条模板链3‘端互补结合。另一