答：1. 获取相应的样品：血液白细胞、羊水细胞、精细胞等。 2. 从样品中提取基因组DNA、总RNA。 3. 目的基因（序列）的PCR扩增。 4. 核酸分子杂交及杂交信号的检测。
６、基因缺失或插入的诊断方法有哪些？试述之？
答：1. DNA印迹法：即Southern印迹。根据印迹片段的大小（电泳区带位置）即可判断基因缺失或插入。基因片段变小（电泳速率快）说明存在基因缺失。基因片段变大说明存在基因插入。但方法繁琐不易临床常规开展。 2. PCR法：基因的碱基缺失或插入部位称之为断裂点。采用跨越断裂点PCR技术（Gap-PCR），就能简便灵敏的检测出基因缺失或插入。基本原理是：设计含一组跨越断裂点的引物对样本DAN进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖电泳。基因缺失时，片段变小，电泳速率较快；基因插入时，片段变大，电泳速度较慢。 ７、基因点突变的诊断方法有哪些？试述之 答：1. 等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
等位基因特异性寡核苷酸（ASO, allele specific olignucleotide）分子杂交是检测基因点突变的简便有效技术。 其基本原理是： （1）设计合成包括突变点在内的正常寡核苷酸探针及突变寡核苷酸探针，将这两种探针进行标记。
（2）设计合成一对引物PCR扩增，包括突变点在内的DNA片段。对样品DNA进行PCR扩增。 （3）将标记的两种探针分别于PCR扩增产物进行杂交，根据杂交信号作用检测判断。由于被检测样品DNA来自PCR扩增产物，故常称为PCR-ASO分子杂交 2. 反向点杂交（RDB,reverse dot blot）
上述的ASO分子杂交，一次杂交只能检测一种点突变，但一种遗传病的基因点突变常有多种类型的突变，就要进行很多次ASO分子杂交过程，这就使得操作过程变得很繁琐。为此，可采用反向点杂交。
针对各种基因点突变类型设计合成各种探针，同时合成正常探针，但对这些各种探针不进行标记。讲所有这些为标记的各种突变探针及正常探针分别点样固定在杂交膜上（固定相，如NC膜）。将PCR扩增产物做液相（ASO分子杂交时是固定相），并对它进行标记。然后与固定在膜上的各种探针进行杂交。这样，一次检验就可同时筛查多重突变，大大提高了基因诊断效率。由于固定相与液相与ASO杂交刚好相反，故称之为RDB。 3. 变性高效液相色谱
上述ASO分子杂交，RDB是用于抑制基因点突变的基因诊断。但有的遗传病及临床表型清楚而突变基因及其突变类型不清楚。对这类疾病的基因诊断称未知基因突变类型的基因诊断。目前使用的诊断技术主要是变性高效液相色谱（DHPLC, denature high performance liquid chromatography）。 DHPLC的基本原理：
（1）HPLC，称为高效液相色谱。是一种液相柱层析技术，由于层析时液体的流动相是用高压泵产生的高压力液体流动，故称之为高效液相色谱。由于流动的液体能使被层析物DNA变性，故DHPLC。
（2）若突变位点是正常的，设计合成引物PCR扩增包括该突变位点在内的DNA片段时。扩增的所有DNA片段都是一致的。只产生一种同源的双链DNA。
（3）若突变点存在着一场(同时也存在着正常)，PCR扩增的单链DNA可随机与另一条互补单链DNA结合成双链DNA。这样就可形成四种双链DNA：两种同源双链DNA，两种异源双链DNA。
（4）对这四种双链DNA进行DHPLC。由于他们分子结构有差异，带电荷多少有差异。在液相色谱柱中滞留时间的长短就不同，从而出现不同特征洗脱峰。但是，这仅只知道DNA片段是否存在着突变，而不知道突变的位点及性质
（5）根据洗脱峰出现的时间，同源正常、同源异常、二个异源DNA进行DNA测序分析，用正常做对照，就检测出突变碱基的位点及性质。因此，DHPLC需与DNA测序分析连用，故称为DHPLC——DNA测序分析 （6）利用DHPLC——DNA测序分析技术，能检测出未知的基因点突变或发现新的基因突变类型。目前，这一技术已形成自动化操作分析仪。 4. DNA测序分析
分离出与疾病发生相关的基因，DNA测序确定其碱基顺序，并用正常DNA作对照，就可确定疾病基因的突变位点及突变性质。由于PCR技术及测序技术的迅速发展，这种分析技术已成为目前基因诊断中最佳的诊断方法。它主要用于抑制点突变的基因诊断以及产前基因诊断，也可以用于未知基因点突变的基因诊断。 ８、基因诊断在遗传性单基因病中有何应用？ 答：基因诊断技术可提供最终的确切诊断与常规的细胞学检查。生化学检测相比，基因诊断耗时少，准确性高。此外，单基因并的筛查及产前诊断方面，基因诊断有重要作用。如：新生儿遗传病筛查、PKV、G6PD缺陷病、β-地中海贫血等（P480）。这些疾病也用于产前基因诊断，告知遗传病受累者做出对妊娠的选择。有的单基因诊断能实现症状前检测，预测个体发病风险。 ９、基因诊断在多基因遗传病中有何应用？
答：多基因遗传病的发生时由于多个基因突变，加之内外环境因素作用而发生。此外单独测定某一两个基因突变，常常不能对疾病做出诊断，只能做出基因突变与该种多基因病发生的相关性分析。如：肿瘤、糖尿病、高血压等。如：基因BRCA和BRCA2突变与乳腺癌的发生有较明显的相关性。（通过检测基因频率而做出相关性分析）。在某些正常人群中，若BRCA或/和BRCA2基因突变频率较高，可对这些人群做出乳腺癌发生的高风险性预测。此外，糖尿病发生的相关基因DQRA1、DQRA2，肿瘤发生相关的抑癌基因、癌基因等。都能对疾病的发生做出相关性分析及疾病发生的风险性预测。
１０、基因诊断在病原体检测中有何应用？
答：针对病原体特定的固有保守核酸序列（DNA或RNA）通过PCR或核酸分子杂交技术确定特殊核苷酸序列存在，从而确定病原体的存在。由于PCR具有高度特异性，高敏感性和快速的特点。只要样品中有微量的病原体，都可做出诊断。（特别对难于培养的病原体，如：结核杆菌、SARS病毒等病原体基因诊断就更具实用价值。）有的基因诊断技术还能做出病原体分型，进来对感染性病原体的耐药基因，通过基因诊断技术能做出检测。
１１、基因诊断在药物疗效评价中有何应用？
答：基因诊断技术能对药物的疗效做出评价。如：慢性粒细胞性白血病（CML），当用纯化疗后是否有效，通过检测残留的白血病细胞而确定。CML细胞中含有一种特殊的融合基因ABL/BCR，通过PCR检测这个基因，就可确定有残留的CML细胞并可做出定量分析。其敏感性很高，105个白细胞中只要有 CML细胞都能检测
出来。
用药指导：通过基因诊断能对用药进行指导。如：氨基糖苷类抗生素有致聋的副作用，其发生于线粒体DNA 12s rRNA基因的第1555核苷酸A→G突变有关。因此，对人群中筛查到第1555位A→G的个体，应避开用这种氨基糖苷类抗生素。又如：药物转化代谢的加单氧酸，其酶分子中的细胞色素P450（cy+P450）具有遗传多态性，某些种多态性。药物的转化快（如麻醉药）；而另一种多态性，药物转化慢。因此，测定cy+P450遗传多态性，能对个体的用药做出预测方案。 １２、什么是ＳＴＲ ＤＮＡ指纹图？ 答：STR DNA指纹图：STR（short tandem repeat）称短串联重复序列，有2-4bp组成重复单位，彼此串联而成。如（CA）n、（GC）n等。不同个体，其重复次数不同，整个STR长度不同，经相应内切酶酶切后，得到大小不同的片段，经电泳分离得到电泳图称之为STR图谱，也称DNA指纹图。它表现高度多态性，除了部分同卵双生子外，个体之间都不相同。法医学中用STR DNA指纹图进行犯罪个体认定，亲子鉴定。
１３、什么是基因治疗？ 答：用分子生物学实验方法将人正常基因或有治疗作用的核酸片段导入人体靶细胞内矫正或置换致病基因，是其回复正常基因结构;或者发导入的具有治疗作用的DNA片段整合到宿主细胞染色体DNA中或独立于染色体外。但DNA片段都能表达基因产物蛋白质，补偿致病基因缺陷所致的功能不足或直接对疾病有治疗作用；或者导入的核酸片段能一直基因过度表达，或封闭有害基因的表达。这些用分子生物学的技术和原理在核酸水平上对疾病进行治疗，称为基因治疗。 １４、基因治疗的基本策略有哪些？试述之 答：主要有三类：
（一）缺陷基因的精确原位修复: 包括基因矫正和基因置换 1. 基因矫正（gene correction）：在染色体上致病基因的原位置处，讲突变的碱基给予矫正为正常的碱基，而基因的其他部分仍予保留。 2. 基因置换（gene replacement）:在染色体上致病基因原位置处，用正常基因替换致病基因，是基因完全恢复正常结构。 这两种方法都是最理想的治疗方法，但目前尚未能再理论上及技术上得到突破。
（二）基因增补
也称基因添加（gene augmentation）：将正常基因导入患者病变细胞内或相关细胞内，随机整合到染色体DNA中或独立于染色体外，不删除突变的致病基因。导入的正常基因表达的蛋白质能补偿致病基因缺陷所致的功能不足或直接对疾病有治疗作用。
（当然，由于导入基因是随机整合，有可能导致原来正常的基因结构发生改变而致一种新的疾病的发生——基因治疗的风险性）。 （三） 基因沉默或失活
基因沉默（gene silencing）：也称基因失活（gene inactivation）
向患者体内导入核酸物质，它能抑制基(siRNA)等，它能使肿瘤细胞中mRNA降解，阻断肿瘤细胞mRNA表达。从而达到治疗疾病的目的。或者抑制激活原癌基因（如Ras）的过度表达。
１５、基因治疗的基本程序包括哪些？ 答：可分为五个步骤：
（一） 选择治疗基因
（二） 选择携带治疗基因的基因载体并将它与治疗基因连接 （三） 选择基因治疗的靶细胞
（四） 在细胞水平和整体水平导入治疗基因 （五） 治疗基因表达的检测。 １６、如何选择治疗基因？ 答：（一） 治疗基因的选择
引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或正常基因经改造后的基因作为治疗基因。如：生长因子、多肽类激素、受体、酶、转录因子等的相应正常基因都可作为治疗基因。根据疾病发生不同，选用不同的基因。 １７、如何选择携带治疗基因的载体？ 答：（二） 选择携带治疗基因的载体
治疗基因载体能将治疗基因携带入细胞内，并能阻止细胞内核酸酶对治疗基因的降解，还能进一步引导治疗基因的表达。目前，基因治疗过程中使用的治疗基因载体主要是病毒载体。野生型病毒载体，由于固有的一些缺点不能直接使用，必须经过加工改造。将病毒基因组中有感染和致病力的相应有害基因剔除，而与基因表达调控有关的基因给予保留。 １８、如何选择基因治疗的靶细胞？ 答：（三） 选择基因治疗的靶细胞
基因治疗所采用的靶细胞通常为体细胞（somatic cell），包括病变组织细胞及正常免疫功能的细胞。
禁用人生殖细胞进行基因治疗，它可涉及下一代的遗传病状。
目前，常用于基因治疗的靶细胞主要有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞、肿瘤细胞等。
１９、将治疗基因导入人体的方法有哪些？
答：体内基因递送（gene delivery）有两种方式： 1. 间接体内疗法（exvivo）：先将接受基因的靶细胞从体内取出，在体外培养。将携带有治疗基因的载体导入细胞内，筛选出接受了治疗基因的细胞，经培养繁殖扩大后再输入体内，使治疗基因在体内表达出相应的产物。 2. 直接体内疗法（invivo）：将外源治疗基因直接注入体内有关组织器官，治疗基因在相应的细胞内进行表达。 ２０、治疗基因表达的检测包括哪些？ 答：1. 表达产物RNA、蛋白质检测
用逆转录PCR、RNA印迹、蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
2. 基因整合及整合部位检测 用DNA印迹法。