条引物与另一条模板链两条3‘端互补结合。
3. 适温下DNA链合成延伸：在72℃左右时，在耐热DNApol（ Taq DNApol ）催化下，以四种dNTP为原料，从引物3’-OH上开始延长合成DNA
上述三步连续反应组成一轮（个）循环，上一轮循环的产物又可作为下一轮循环的模板。三步连续反应不断循环，经过 25-30 轮循环后，扩增基因片段的拷贝数可达到百万倍以上。扩增的DNA片段长度基本是两条引物 5’端之间的 DAN片段。
8、PCR引物应具备哪些条件？
答：1、PCR引物为一对（两条）DNA单链：其中一条引物与模板双链DNA中的一条模板单链的3’端相应部位碱基互补。另一条引物与另一条模板单链的3’端互补结合。
2、引物长度：约15-20个核苷酸。
3、引物与模板DNA非扩增区不应该存在碱基互补，否则，将产生一些非特异性的扩增产物。
4、引物的 3’端碱基，一定要与模板互补，否则将不产生延伸效应。 5、引物的 5’端碱基与模板的互补要求不十分严格，甚至可游离十几个碱基而不影响 PCR 扩增反应。
6、PCR扩增片段长度：复性时两条引物 5’端之间的DNA片段。 9、PCR的主要用途有哪些？试述之。 答：（一）获得目的基因，用于目的基因的克隆
根据目的基因两端的碱基顺序，设计合成一对引物从基因组DNA 或 cDNA中进行 PCR扩增，获得目的基因片段。 （二）体外基因定点突变
根据对突变的要求（点突变、缺失突变等）设计合成相应的突变引物，然后进行分段PCR扩增，最后将分段扩增产物再融合扩增。于是定点突变（引物）就嵌入到基因组中。
（三）对微量DNA及RNA进行分析
在PCR未出现之前，由于微量DNA信号太弱，不易进行分析 。PCR具有高度敏碱性，微量DNA（哪怕是一滴血或一根头发中的一个DNA分子）经PCR扩增后可得到基因的大量拷贝，便于进行定性及定量分析。这在基因诊断、法医中犯罪对象认定及亲子鉴定等方面，都有广泛的应用前景。 （四）DNA序列测定
从基因组DNA经PCR扩增得相应的目的DNA片段后，通过DNA自动测序仪或手工操作法进行DNA直接测序。也可用核酸杂交等方法进行间接测序。 （五）基因点突变分析 1，引物特异性PCR
2，PCR-SSCP（单股链构象多态性）
3，等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO) 4，基因芯片技术
10、什么是引物特异性PCR？什么是PCR—ASO？ 答：（1）、引物特异性PCR：从基因组DNA经PCR扩增得到目的基因，针对目的基因突变点的碱基性质设计合成 3‘ 端与之互补的引物，又进行PCR扩增，于是，突变阳性的基因有扩增产物，突变阴性的基因，没有扩增产物，称之为引物特异性PCR。等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO)：
（2）、PCR 扩增突变基因，合成针对突变点的探针，将它与扩增产物杂交，杂交阳性说明有相应的基因突变存在。 11、什么是RT—PCR？什么是原位PCR？ 答：（一）RT—PCR（逆转录PCR） RT—PCR（reverse transcription PCR）是将 RNA 逆转录反应与 PCR反应联合应用的一种技术。首先，以RNA为模板，经逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，经 PCR 扩增目的基因。目前，RT—PCR是真核细胞mRNA进行定性及半定量分析的有效方法。 （二）原位PCR 原位PCR（in situ PCR）是在组织切片或细胞涂片的细胞内进行PCR。对扩增产物用特异性探针与之进行原位核酸杂交，从而检测出待测DNA或RNA的存在以及存在的部位。虽然这种方法的灵敏度不高，但它是目的基因定位的一个最佳方法。
12、非探针类实时荧光定量PCR的基本原理是什么？
答：原理：在常规PCR时，加入特殊的荧光染料SYBR Green，这种染料能与双链DNA的小沟区域结合。当这种染料未与DNA结合处于游离状态时，荧光信号强度极低。一旦它与双链DNA通过小沟区域结合后，荧光信号大大增强，约为游离时的1000倍。PCR扩增产物双链DNA越多，荧光信号就越强，下一轮循环变性时，双链DNA能形成单链，荧光近消失，待这一轮循环结束，产生双链DNA时，又出现大量荧光。这样，实时记录了荧光量即DNA量。
13、探针类实时荧光定量PCR有哪三种？试述TaqMan探针法的基本原理。 答：根据使用探针不同又分为：TagMan探针法，分子信标探针法及荧光共振能量转移探针法。
TaqMan探针法基本原理：
①在常规PCR反应体系中，加入一条能与模板DNA特异结合的TagMan探针，这个探针的5｀端标记有荧光报告基团R（reporter， R），3｀端标记有荧光淬灭基团Q（quencher，Q）。
②当探针上报告基团R及淬灭基团Q同时存在时，无荧光信号释放。当R基团与Q基团分离时，R基团便能产生荧光信号。
③PCR扩增时，DNA链合必延长，当遇到与模板DNA结合的探针时，Taq DNApol发挥5’ 3’核酸外切酶活性，将探针5‘ 端的R基团水解下来，产生荧光。由荧光检测系统收集。探针余下部分，继续由Taq DNApol 水解切除。PCR扩增继续向前，直至此循环结束。在下一轮循环，产生上述同样过程，收集荧光信号。 ④这样，TagMan 探针就在每一轮PCR扩增时，就实时测定PCR产物的量（荧光量）。
14、什么是基因组DNA文库？什么是cDNA文库？
答：从细胞中提取总基因组DNA，用相应的限制性核酸内切酶酶切，得到大小不同的许多各种基因片段，将这些基因片段分别与相应的基因载体（如噬菌体载体）连接重组。于是形成各种重组体，将所有这些重组体转导入合适的受体细胞中（如大肠杆菌），对受体细胞进行培养扩增，从而获得含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体，它可以涵盖该种生物基因组的全部基因信箱，称之为基因组DNA文库。
从细胞（液）中提取mDNA，通过转录得到相应的各种cDNA 。然后将这些cDNA分别与相应的载体（质粒载体或噬菌体载体）连接，得到各种重组cDNA。将所
有这些重组cDNA转录入合适的受体细胞内进行克隆培养，从而获得多克隆cDNA 片段的混合体。它包含了一种组织细胞中全部mDNA信息。称之为cDNA文库。 15、什么是基因芯片？什么是蛋白质芯片？
答：一、基因芯片（gene chip）技术是以反向点杂交为基础而建立的一种高效高通量的自动化分析技术。其基本原理是：
针对各种基因突变类型合成各种探针以及正常探针，但不对它们进行标记。通过自动化微点样技术将这些未标记的探针依次排列布阵在固相支持载体玻片或尼龙膜上。将待测样品DNA（常来自 PCR）进行荧光标记，与固定在固相支持载体上的各种探针进行微杂交，荧光检测系统对芯片进行扫描收集荧光信号（荧光共聚焦扫描），经计算机软件进行比较分析处理，就可得出检测结果。由于探针布阵密集，1cm2 内可布阵数万个基因，同一时间的一次检测可分析大量基因，故称基因芯片。 二、蛋白质芯片
将针对各种不同蛋白质的相应抗体蛋白作为探针，将这些各种蛋白探针用微点样技术布阵在固相支持载体尼龙膜等上面，形成蛋白质芯片。将待测蛋白质进行荧光标记并与芯片上的各种蛋白质探针进行结合反应，于是特异的蛋白质与它特异的抗体（蛋白探针）之间产生特异的抗原—抗体亲和反应而结合。此时芯片上就可产生特定的荧光信号，通过激光扫描收集荧光信号，再经计算机软件处理就可得出检测结果。
第二十一章 DNA重组及DNA重组技术
1、什么是基因克隆？ 答：基因克隆：在体外将目的基因与载体DNA连接起来形成重组DNA（基因重组），然后采用适当的物理、化学及生物学方法将重组DNA导入合适的受体细胞内，通过对阳性受体细胞进行克隆培养，于是，目的基因在受体细胞内不断地复制得到大量基因拷贝，并转录和翻译出相应的目的蛋白质，这一过程称基因克隆及克隆基因的表达。
2、限制性核酸内切酶（Ⅱ型）的作用特点有哪些？ 答：（1）RE作用于DNA分子内部，使两条单链水解切断，分别产生5’-P端 及3’-OH端。
（2）RE的识别酶切部位，具有特殊的碱基顺序，通常为4-6个碱基的回文结构（Palindrome），也称反向重复序列。如 EcorⅠ的识别顺序为：
5’—G A A T T C—3’ 3’—C T T A A G—5’ （3）切割方式：
在识别部位，切割DNA双链，产生两种不同的末端： ① 粘性末端（粘端）：在识别部位对称的不平齐切开DNA双链，产生单链突出的互补粘性末端：
a，若从5’ 端切割，产生5’端突出的粘性末端，如 BamHⅠ 5‘—GGATCC—3’ 3’—CCTAGG—5’
b，若从3’端切割，产生3’端突出的粘性末端。如PstⅠ 5‘—CTGCAG—3’
3’—GACGTC—5’
②平头末端（钝性末端） ：在识别的碱基部位，对称地平齐切开DNA双链。如Sma Ⅰ
5‘—CCCGGG—3’ 3’—GGGCCC—5’ 3、什么是同尾酶？什么是同裂酶？
答：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这些酶彼此互称为同尾酶（isocaudarner）。所产生的相同的粘性末端称为配伍末端。
来源不同的限制性内切酶酶，但能识别和切割同一序列，这些酶称同裂酶或异源同工酶。
4、什么是基因载体？
答：基因载体：外援目的基因一般很难自由进入受体细胞内，即使能进入，也很难在受体细胞内进行复制和表达。为此，就要寻找一种特殊结构的DNA分子,它既能将外源目的基因带入受体细胞内，还能引导目的基因在受体细胞内进行复制和表达，称此特殊的DNA分子为基因载体，简称载体（vector）。根据载体功能不同又分为克隆载体（cloning vector）及表达载体（expression）。 5、什么是克隆载体？它具有哪些基本特点？ 答：克隆载体是用来在宿主细胞中获得目的基 因的大量拷贝。
克隆载体应具备的基本特点
（1）具有复制起始点：它能使载体在宿主细胞内进行自主复制，同时能使带入的外源目的DNA片段进行同步复制扩增。
（2）含有可供筛选用的选择标志（selection marker）常称遗传标志，便于对阳性转化细胞进行筛选。重组DNA转化受体细胞时，并非每个细胞都转化成功，对转化成功的细胞进行筛选，就依赖这些选择标志。
（3）含有一个或多个限制性内切酶的单一酶切位点，便于目的基因插入。若载体中某一段特异核苷酸序列，含有多种限制性内切酶（RE）的单一酶切位点，称这段序列为多克隆位点（MCS,multiple cloning sites）。
6、什么是表达载体？什么是原核表达载体？它的基本特点是什么？
答：表达载体是用来在宿主细胞中表达外源目的基因。根据表达宿主细胞不同，又分为原核表达载体（prokaryotic expression vector）及真核表达载体（eukaryotic expression vector）。
原核表达载体是用于在原核细胞中表达外源目的基因。它是由克隆载体发展而来。除了具有克隆基因载体的一些特点而外，还需具有调控外源目的基因进行转录和翻译的一些调控序列、转录终止序列等。 7、什么是真核表达载体？它具有哪些特点？ 答：真核表达载体
这类载体用于在真核细胞中表达外源目的基因，它也是由克隆载体发展而来，除了具有克隆载体的特点外，还应具有如下的特点：
① 它应具有真核表达的相应调控元件，包括增强子、启动子、转录终止信号、polyA 加尾信号等
② 具有真核细胞复制起始序列（富含AT序列）
③ 用于真核细胞阳性克隆筛选的筛选标志，常是药物抗性基因，如TryⅠ基
因等。
真核表达载体根据宿主细胞不同，又分为：酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体等。
8、重组DNA技术包括哪些基本过程？如何获得目的基因？ 答：一个完整的重组DNA过程包括五大步骤，简称为： 分、选、接、转、筛
（一）目的基因的分离获得—分
１、人工化学合成法：用DNA自动合成仪合成，主要用于小片段DNA合成，若基因片段太长，先分段合成后再连接成长片段基因。
2、从基因文库中获得：从基因组文库及cDNA文库中，采用核酸杂交等方法获取目的基因。
3、PCR法：是目前最常用的方法，根据目的基因两端的碱基顺序合成一对引物，经PCR扩增获得目的基因。
4、其它方法：如酵母杂交法系统克隆得与蛋白质特异相互作用的基因等。 9、如何选择基因载体？ 答：载体的选择与构建—选
DNA克隆目的主要有二个： ① 获得目的DNA片段的大量拷贝
② 获得目的DNA片段的表达产物蛋白质。 针对目的①应选用克隆载体。针对目的② 应选用表达载体
此外，还要根据目的DNA片段大小，受体细胞的种类、来源等对载体进行选择。有的克隆过程要求载体上有多克隆位点（MCS） 10、目的DNA与基因载体的连接方法有哪些？试述之 答：1、粘端连接法（粘性末端链接法）
（1）单一相同粘端链接法：用同一种限制性核酸内切酶（RE）切割目的DNA及载体DNA，产生完全相同的单链互补粘性末端，然后由连接酶催化将目的DNA与载体DNA连接起来。
（2）不同粘端连接法：用两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA。结果，目的DNA及载体DNA的两端就可产生两个不同的粘端，于是目的DNA就能定向的插入载体中。这种使目的DNA按特定方向插入载体的克隆方法。称之为定向克隆（directed cloning）. （3）其它粘端连接法
① 人工接头法：人工合成含有某种RE酶切位点的双链寡核苷酸称之为接头（adaptor），然后将此接头与目的DNA连接起来。用同一种RE酶切带接头的目的DNA及载体DNA，产生单一相同粘端，再由连接酶催化将二者连接。
②同聚物尾法：在末端转移酶催化下，将一种核苷酸（如dc）逐一连接在目的DNA的3’端，形成同聚物尾。用同样方法将另一互补核苷酸（如dG）逐一连接在载体DNA的3’端，形成互补的同聚物尾，于是粘端连接法将二者连接起来。 ③ PCR法：针对目的DNA两端设计合成一对特异性引物，在每条引物的5’端分别连接上不同的RE的酶切位点。当用这种引物以目的DNA为模板进行PCR扩增时，得到的扩增物目的DNA的两端就分别含有不同RE的酶切位点。用这两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA，于是，目的DNA就能定向插入到载体DNA中。 2、平端连接法