目的DNA及载体DNA两端均为平端时，由DNA连接酶催化将二者连接起来 3、粘—平末端连接法
目的DNA两端与载体DNA两端连接时，其中的一端为粘端连接，另一端为平端连接，称粘—平末端连接法。
11、什么是感受态态细胞？重组DNA转入宿主细胞的方法有哪些？
答：感受态细胞：用化学物理方法处理宿主细胞，使之成为接受外源DNA的最佳状态，称之为感受态细胞。
重组DNA转入宿主细胞的方法有：
1、转化：重组质粒转入大肠杆菌称转化。重组质粒直接导入酵母细胞也称转化。使用方法有氯化钙化学诱导法，电穿孔法等。
2、转染：外源DNA直接导入真核细胞（酵母细胞除外）的过程称转染。使用方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法、显微注射法、电穿孔法等。
3、感染：以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA，再包装成病毒颗粒，通过感染的方式将重组DNA转入细菌体内或哺乳动物细胞。
12、借助载体上遗传标志进行筛选阳性重组细胞的方法有哪些？试述之？ 答：（1）利用抗生素抗性标志筛选：如用质粒作为载体构建重组体，质粒上有AmpR（抗氨苄青霉素基因），当这种重组DNA（体）导入细胞后，这种细胞对Amp 就有抵抗性，在含有Amp 的培养基上就能生长。而导入不成功的细胞，对Amp没有抵抗性，在含有Amp 的培养基上就不能生长。
（2）利用基因插入失活法筛选：质粒PBR322中含有AmpR 及 TetR(抗四环素基因)。在TetR中，含有限制性内切酶 BamHI 的酶切位点，当用这个RE酶切 PBR322 及目的基因，使目的基因插入到 TetR中，于是TetR 失活。结果，重组体转化成功的细胞在含有Amp的培养基上能生长，而在含有Tet的培养基上则不能生长。 （3）利用基因插入表达法进行筛选：质粒PTR262构建重组时，PTR262中含有CI基因，其表达的阻遏蛋白能抑制TetR的表达。CI基因中有RE酶切位点，当插入目的基因构建重组体质，CI基因失活，不能表达出阻遏蛋白。于是TetR去阻遏， TetR表达。结果，转化成功的细胞，在含有Tet的培养基上就能生长。 （4）利用标志补救筛选 标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，其表达产物能互补宿主细胞的相应缺陷，从而使阳性重组细胞能再相应的培养基中存活。
（5）利用噬菌体的包装特性进行筛选
噬菌载体与目的外源DNA重组时，其总长度应为噬菌体野生型长度的75%—105%时，才能包装成有活性的噬菌体颗粒，于是在培养基上呈现出清晰的噬菌体斑。不含外源目的DNA的噬菌体载体，由于长度太少，不能包装成有活性的噬菌体颗粒，培养基上就看不见噬菌斑。
13、序列特异性筛选阳性重组细胞的方法有哪些？试述之？ 答：（1）RE酶切法：从克隆细胞中提取重组DNA，经合适的RE酶切得到大少不同片段，经琼脂糖电泳分离各片段，根据各片段位置不同而比较大小（bp）与标准样比较即可做出筛选。
（2）PCR法：从重组细胞中提取DNA，用特异性引物扩增目的DNA片段，经电泳分离，并与标准目的DNA比较，即可做出筛选。
（3）核酸杂交法：常用的是菌落或噬菌斑原位杂交，将克隆的菌落或噬菌斑印压至硝酸纤维膜（NC膜）上，然后将细菌裂解（酶裂解）释放出DNA，并吸附固
定在NC膜上，将标记的核酸探针与之杂交，通过有无杂交信号（放射自显 影、化学发光等）而确定有无阳性杂交体，进而 确定有无目的DNA存在。
（4）DNA测序法：将分离的重组DNA进行DNA自动测序，与标准序列比较，能准确的鉴定目的DNA。 14、什么是亲和筛选法？ 答：亲和筛选法：重组DNA表达出相应的蛋白质，它是抗原或抗体；配体或受体。将这种蛋白质吸附固定在NC膜上，将标记的抗原或抗体；受体或配体作为探针与被探测的蛋白质进行抗原—抗体，配体—受体反应。根据这种蛋白质杂交反应是阳性还是阴性，从而做出检测结果。 15、什么是原核表达体系？大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表达载体应具备哪些条件？ 答：原核表达体系
原核表达体系与目前常用E.coli表达体系，其优点是培养方法简单，整个工艺过程经济方便。
（1）E.coli表达载体应具备下列条件： ① 含有可供筛选用的选择标志，如Ampr
② 具有强启动子：如 Lac启动子或其它的强启动子序列。这样能转录产生大量的mRNA
③ 含有合适的翻译调控序列：如核糖体结合位点，SD序列等 ④含有合适的多克隆位点（MCS），这样保证目的基因按一定的方向与载体进行正确的连接。
16、什么是融合表达体系？有何优点？
答：表达多肽链的C端是克隆目的肽段的DNA编码，N端是原核标签肽的编码序列。这样，表达的蛋白质是由目的蛋白质多肽链及一段原核多肽链组成—称之为融合蛋白。 优点：
a、表达蛋白稳定，不易受细胞内源性蛋白酶的降解。
b、容易分离纯化：根据标签肽的特性，用亲和层析法分离融合蛋白，然后再水解出去标签肽，最后得到目的蛋白质。
17、什么是真核表达体系？真核表达载体具有的基本条件是什么？真核表达载体有何优点？
答：真核表达体系
（1）包括酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达体系等
（2）真核表达载体除了与原核表达载体具有相似之处而外，如选择标记、启动子、转录及翻译终止信号。还应有自己特有的序列，如 mRNA polyA 加尾信号等。
（3）优点：真核表达体系的优点是
① 即可表达克隆cDNA，还能表达真核基因组DNA ② 能对表达的蛋白质进行适当的修饰
③ 表达蛋白质能恰当地分布在细胞内一定区域并积累。 18、重组ＤＮＡ技术在医学中有何应用？ 答：重组DNA技术在医学中的应用：
一、生物制药：利用重组DNA技术生成有药用价值的蛋白质。如干扰素、胰岛素、乙肝疫苗、单克隆抗体等。
二、定向基因改造，通过转基因或基因打靶，获得具有特殊遗传性状的生命体。
三、进一步阐明疾病发生的分子机制。 四、促进了基因诊断、基因治疗的发展。
第二十三章 癌基因、肿瘤抑制基因
１、什么是细胞癌基因？常见的有哪些？
答：细胞癌基因（celluar encogene, c-onc）也称原癌基因是细胞基因组中正常存在的基因，其表达产物作为细胞周期的正调控信号，对细胞正常生长：繁殖、发育和分化起着精确的调控作用。细胞癌基因的表达产物包括生长因子受体：细胞内信号转录分子以及与生长有关的转录调节因子等。 常见的细胞癌基因有： sis, src, ras, erb, myc等。
２、什么是病毒癌基因？它与细胞癌基因比较，有哪些不同？
答：病毒体内的一种基因，当它感染宿主细胞后，能引起宿主细胞癌变，称此种基因为病毒癌基因（v-onc）。病毒癌基因原本不是病毒的，是病毒感染宿主细胞后，经整合、重组、剪切从细胞原癌基因获得的，因此它是细胞癌基因的一个复本。但病毒癌基因与c-onc比较，没有内含子、编码区较短。由于重组获得过程中，发生了一些碱基突变，因此v-onc的致癌性较c-onc要强。 ３、什么是癌基因的活化？其活化机制有哪些？试述之
答：细胞癌基因在物理、化学及生物学因素作用下发生突变，于是其表达产物的质和量发生改变，表达方式在时间及空间上发生变化，结果细胞信号调控失常，导致细胞恶性增值而发生癌变。这种由正常的细胞原癌基因转变成具有致癌活性的癌基因的过程，称原癌基因的活化。其活化机制主要有四种 （一）获得强的启动子或增强子 ? 逆转录过程中强的启动子或增强子，当其感染宿主细胞后，强启动子或增强子正好整合在宿主细胞原癌基因的附近或内部，于是，原癌基因受强启动子或增强子调控，表达过量，细胞过度增殖而发生癌变。 （二）染色体易位
? 染色体易位，使某些原来无活性或低活性原癌基因转位主强启动子或增强子附近，于是，原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。 （三）基因扩增
? 原癌基因由于某些因素的作用，使其复制加速，基因扩增（gene amplification）. 基因拷贝数可增至几十倍乃至上千倍，于是，基因编码产物表达过量，导致细胞癌变（转化）。 （四）点突变
? 在一些物理、化学因素的作用下，导致原癌基因发生点突变，从而使表达的蛋白质结构及功能异常。 ?
４、原癌基因的表达产物有哪些？各有何功用？试述之
答：原癌基因的表达产物参与调控细胞的增强分化以及细胞生长的各个环节，这些表达产物有:
（一）细胞外生长因子
细胞外生长因子是细胞外增殖信号，它们作用于细胞膜受体。经信号通路传递，引发细胞增殖相关基因的转录激活，维持细胞的正常生长增殖，当这些因子过度表达时，将致细胞恶性增殖，发生癌变。 （二）跨膜生长因子受体
它接受细胞外生长因子信号并将其转入细胞体内，通过一定的细胞信号传递过程，加速细胞增殖信号在细胞内传递。跨膜生长因子受体 表达过量，同样导致细胞恶性增殖。
（三）细胞内信号转导分子 生长信号到达细胞内后，借助一系列细胞内信号转导体系，将生长信号由细胞内传递至细胞核内，进而促进生长。原癌基因表达产物作为细胞内信号转导分子主要有酪氨酸激酶，苏氨酸激酶，G蛋白等。 （四）核内转录因子
原癌基因表达的蛋白质—核内转录因子，通过它与靶基因的顺式作用元件相互作用，直接促细胞增殖基因的转录。
５、什么是肿瘤的抑制基因（抑癌基因）？
答：肿瘤抑制基因常称为抑癌基因，它是细胞内一正常基因，其表达产物能诱导细胞分化，维持基因组稳定性，触发或诱导细胞的程序性凋亡，抑制细胞过度增殖，对细胞周期过程起负性调控作用，从而调节细胞的正常生长。当抑癌基因突变时，导致细胞异常生长和增殖而发生癌变。
６、ＲＢ基因表达的蛋白质是什么？当ＲＢ基因发生缺失突变或 点突变时所产生的病理学效应是什么？
答：RB基因定位于染色体1314，有27个外显子，mRNA全长4.7kb，表达产物为105kpa的蛋白质，属转录因子，称Rb蛋白。Rb蛋白磷酸化后活性增高，脱磷酸化后活性降低。当Rb基因缺失或突变时，细胞周期负性调控失调，导致细胞异常增生（癌变）。
RB基因缺失或突变常导致视网膜母细胞瘤（Rb,retinoblastoma）及骨肉瘤的发生。此外，小细胞性肺癌，乳腺癌、膀胱癌及前列腺癌的发生，也与RB基因的突变失活有关。将RB基因导入Rb细胞或骨肉瘤细胞，这些细胞的恶性生长受到抑制。
７、ＴＰ５３基因表达的蛋白质是什么？有何功用？
答：TP53基因定位于染色体17P13，全长16、20kb，含有11个外显子，转录的mRNA全长2.8kb，表达的蛋白质称P53蛋白，具有转录因子活性。 功用：野生型P53蛋白在维持细胞正常生长，抑制细胞过度增殖过程中起重要作用。P53蛋白随时监控染色体DNA的完整性，一组DNA遭受损害， P53蛋白将与特定的DNA序列结合，通过激活P21基因等过程，使DNA得到完全修复。如果修复失败， P53即启动促凋亡过程诱导该细胞自杀，防止转变成恶性细胞。 ８、什么是显性负突变？
９、答：突变的P53蛋白能与野生型P53结合形成无功能寡聚蛋白，使野生型P53蛋白失活，导致肿瘤发生，称显性负突变。
１０、细胞癌基因、抑癌基因在肿瘤发生中的作用是什么？ 答：1、癌基因：因基因突变而激活，细胞过度增殖而癌变。
2、肿瘤抑制基因：因突变而失活，不能正常地抑制细胞过度增殖，于是细胞恶性增长。
１１、癌基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、ＤＮＡ损伤修复基因在肿瘤发生中的作用是什么？
答：1、癌基因：因基因突变而激活，细胞过度增殖而癌变。
2、肿瘤抑制基因：因突变而失活，不能正常地抑制细胞过度增殖，于是细胞恶性增长。
3、细胞凋亡基因：它保证细胞的正常程序性死亡，即正常凋亡。细胞凋亡基因有多种，主要有BCl家族，它又分为促凋亡基因及抑凋亡基因。
第二十五章 基因诊断及基因治疗
１、什么是分子诊断？什么是基因诊断？ 答：（1）、用分子生物学的理论和技术在分子水平上对引起疾病的遗传基因、病原体及肿瘤相关基因以及他们的表达产物RNA（尤其是mRNA）和蛋白质进行结构定性及定量分析，从而对疾病做出诊断。称之为分子诊断（molecular diagnosis）。 （2）、DNA、RNA（尤其是mRNA）是遗传信息的载体，针对分析这些信息分子的序列结构、基因变异导致功能改变而引起疾病发生，称之为基因诊断（gene diagnosis）。
２、基因诊断的优点有哪些？
答：1. 特异性：针对特定基因，采用核酸杂交、 PCR技术等进行诊断，表现高度特异性。
2. 高度敏感性：基因诊断采用PCR技术，具有放大效应。故其灵敏度高。 3. 基因诊断是在源头上认识基因是否正常及其与疾病发生的关系。
4. 适用性：诊断范围广。基因诊断即可诊断引起疾病的基因，也可诊断引起肿瘤的相关基因，还能诊断病原体基因，从而确定相应病原体的存在。 ３、基因诊断的基本条件是什么？
答：1.基因诊断的前提是疾病表型与基因型的关系已被阐明。
2.疾病相关基因的染色体定位、功能及基因克隆的相关知识已解释 清楚或基本清楚。因此，对于一种疾病表型及其相关基因型的有关知识一点都不清楚，是无法进行基因诊断的。 3.目前，基因诊断仅仅只能用于单基因病的基因诊断。如：β-地中海贫血、G6PD缺陷病、PKV、高LDL血症等。而对于多基因病的基因诊断，目前还处于研究过程中。
４、基因诊断用样品主要有哪些？
答：1.基因诊断用的样品有：血液、组织块、羊水和绒毛、毛发、精液、唾液、尿液等。
2.根据分析目的可以从样品材料中提取基因组DNA、各种RNA（尤其是mRNA）。 3.有的分析目标是cDNA，可用提取的RNA经逆转录得到cDNA。
4.要对RNA进行分析时，样品必须新鲜。固RNA不，易受细胞内RNA酶的降解。在从样品中提取RNA时，要加入RNA保护剂DEPC（焦炭酸二乙酸）
5.产前对胎儿进行基因诊断时，可从羊水细胞、绒毛细胞或脐带血有核血细胞，母亲外周血中分离出的胎儿有核血细胞中提取DNA。 ５、基因诊断的基本步骤有哪些？