(3) 将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。
(4) 小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。
(5) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。
五、实验结果和报告
1绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。 2试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的？ 六、思考题
1制片时为什么不能加热固定？
2没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？真实地记录你观察到的现象，并进行解释。
3鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种? 4根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?
5试设计—实验，如何鉴别某种细菌是否能运功，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。
实验四 细菌的芽孢、荚膜染色
一、实验目的
1掌握细菌的芽孢染色法。
2掌握细菌的荚膜染色法。 二、实验材料
1 枯草芽抱杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。
2 二甲苯、香柏油、蒸馏水、5％孔雀绿水溶液、0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95％乙醇、石炭酸复红染液。
3显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(1x6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。 三、实验方法和步骤
（一）芽孢染色法 1方法1
(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 (2) 于载片上滴入3-5滴5％孔雀绿水溶液。
(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5) 用0．5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 2 方法2
(1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养18-24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。
(2) 加5％孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15-20min。
(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
(6)加沙黄水溶液，染2-3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 (7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。 (二)荚膜染色法 1石炭酸复红染色
（1）取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。 (2)滴入1-2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。 (3)加石炭酸复红染液染色1-2min，水洗，自然干燥。
(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一张边缘光滑的载玻片与墨汁接触，涂成均匀的薄层，自然干燥。
(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。2背景染色
（1）先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。 (2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。
(3)干燥后用油镜观察。背景黑色，菌体较暗。在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 四、实验报告 (一)绘图
1枯草芽孢杆菌的芽孢形态，芽孢的着生位置。 2褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。
(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜? 五、问题和思考
1为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 2组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?
3试设汁实验如何鉴定果一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。
实验五 放线菌的形态观察
一、实验目的
1辨认放线菌的基本结构：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态； 2用水封片法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征。 二、实验材料
1细黄链霉菌的平皿培养物，棘孢小单孢菌的玻璃纸平皿培养物。 2 0.1％美蓝染色液、石炭酸复红染色液。
3盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。 三、实验方法和步骤
(一) 观察自然生长状态的放线菌
用镊子小心取出用插片法培养的细黄链霉菌皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦干净，然历将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，注意放线菌的基内曲丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 (二) 水封片观察
取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养的棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌的面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中。制成水封片，
用高倍镜观察其中个分生孢子及其基内菌丝。 （三） 玻璃纸法的镜检观察
1直接玻璃纸观察 分别用细黄链霉菌和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况、再用高倍镜仔细观察。注意区分黄链霉菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。
2 印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有黄链霉菌或棘孢小单孢菌的平皿并轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态，反转有印痕的载玻片微微加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，晾干。用油镜观察。 四、实验结果和报告
l 绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的； 2 试比较细黄链霉菌与棘孢小单孢菌特征的异同。 五、问题和思考
l 在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝? 2用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?
实验六 霉菌的形态观察
一、实验目的
1 掌握微生物载玻片湿室培养方法。 2 曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。 3 根霉假根的观察。 二、实验材料
1 产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉等斜面菌种。
2 半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20％甘油。
3 透明胶带、剪刀、培养皿、载玻片、门形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、接种环。
三、实验方法和步骤
(一)霉菌的载玻片湿室培养
1准备湿室：在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“门”形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎。经12l℃湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。
2取菌接种：用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。
3 加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处。培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以1/2小滴为宜)。
4加盖玻片 在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压。使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁．否则不透气。
5 倒保湿剂 每皿倒人约3mL 20％的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润滑，以保持皿内湿度。皿盖上注明菌名、组别和接种日期；此为制成的载玻片湿室，置28℃恒温培养3-5天。
(二)黑根霉假根的培养
将融化的PDA培养基，冷却至50℃倒入无菌平皿，其量约为半皿高度的1/2、冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。然后将平皿倒置，在盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2-3天后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构。
(三)镜检观察
1 湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养16-20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、曲丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和泡囊孢子。
2 粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。
3假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。
4制成永久装片 把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。 四、实验结果和报告
绘制并标注镜几种霉菌镜检形态图 五、问题和思考
1 什么叫载玻片湿室培养，它适用于观察怎样的微生物，有何优点?