2 RCM培养基(即强化梭菌培养基)、TYA培养基、玉米醪培养基、中性红培养基、明胶麦芽汁培养基。CaCO3，焦性没食子酸(即邻苯三酚)、Na2CO3，10％NaOH溶液，0.5％美蓝水溶液，6％葡萄糖水溶液，钯粒(A型)，NaBH4，K BH4，Na2HCO3，柠檬酸。
3 带塞或塑料帽玻璃管(直径18-20mm，长180-200mm)，100mL和250mL血浆瓶，20m1和50mL针筒，250mL三角瓶，试管，厌氧罐，厌氧袋(不透气的无毒复合适明薄膜塑料袋，14cmx32cm)，培养皿，真空泵，带活塞干燥器，氮气钢瓶。 三、实验方法和步骤 （一）深层穿刺厌氧培养法
此法操作简单，适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养，但不能用于扩大培养。 1接种培养：将玻璃管一头塞上橡胶塞，装入培养基(RCM或TYA培养基)的高度为管长的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，灭菌并凝固后，将丙酮丁醇梭菌用接种针穿刺接种，置37℃恒温箱中培养6-7d。
2 观察结果：观察菌落形态特征并制片，于显微镜下观察菌体的细胞形态，并记录结果。
(二)针筒厌氧培养法
此法适于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。
1培养基制备：将灭菌的装合RCM或TYA培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热10min，在瓶口胶塞上插上2枚针头排气，以赶出残留在培养基内的氧气。随后将血浆瓶从沸水浴中取出，再用氮气钢瓶中的高纯氮气(99.99％)通过胶塞上的一枚针头引入血浆瓶中，使血浆瓶内充满氮气，瓶内培养基在冷却过程中保持无氧状态。 2针筒装灌培养基：将灭菌的针筒接上针头经胶塞刺入血浆瓶中，先利用瓶内氮气的压力将针筒的推杆慢慢推开，待吸入一定体积的氮气后取下针筒，排尽针筒内的气体，按此重复操作3次，以排尽针筒内的残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口朝下倾斜，利用瓶内压力将培养液缓慢灌入针筒内，然后取下针筒，用经灭菌的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住。
3接种培养：采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中，置37℃恒培养，用于菌种活化可培养16-18h，用于测定菌体生长可培养6-7d。 4观察结果：取菌制片观察。 四、实验结果和报告
1实验中选用厌氧培养法的培养结果。
2试比较以上厌氧培养方法的优缺点，并分析其成功的关键。 五、问题和思考
1请设计一个试验方案，如何从土壤中分离、纯化和培养出厌氧菌。
2试举例说明研究厌氧菌的实际意义。 六、注意事项
1培养需要CO2的厌氧菌时，须在厌氧小环境中供应CO2。
2选用干燥器、针筒、厌氧罐或厌氧袋时，应事先仔细检查其密封性能，以防漏气。 3已制备灭菌的培养基在接种前应在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培养基中的氧气。
4针筒培养液刃天青指示剂出现红色，表明有残留氧气。厌氧袋和厌氧罐中美蓝厌氧度指示剂变成蓝色，表明除氧不够。
5产气荚膜梭菌为条件致病菌，防止进入口中和沾上伤口。
实验十二 环境条件对微生物生长的影响
一、实验目的
1了解营养元素的种类及含量对微生物生长的影响。
2了解氧气、温度、pH、盐等环境因素对微生物生长的影响。
二、实验原理
环境条件会影响微生物的生长，不同的微生物在生长时需要不同的环境条件。微生物按其对环境条件的需求可以分为好氧、厌氧微生物、嗜酸碱／中性微生物和中温／耐高温／耐低温微生物等多种类型。温度、酸碱度可以影响微生物细胞的稳定性及催化反应的酶的活性，从而影响微生物的活力和生长状况。微生物生长对渗透压也有要求，除了一些嗜盐微生物需要在有高浓度的盐存在的条件下才能生存外，一般微生物都只能在一定的盐浓度下生长。对好氧微生物来讲，氧气作为呼吸电子传递链的末端电子受体，是其生长所必须的。但对厌氧微生物来讲，由于氧的存在会使其体内产生具有破坏作用的自由基，氧气对这些微生物是一种有毒物质。因此，对于一个给定微生物必须通过多种试验来确定其最佳的生长条件。 三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、无碳无氮基础盐培养基、淀粉、葡萄糖、硫酸铵、硝酸钾。
3、仪器设备：721分光光度计、可控温摇床。 四、实验方法和步骤
（一）环境条件对微生物生长的影响 1通气条件对微生物生长的影响
（1）将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装至250ml的三角瓶中，分装成30ml、50ml、100ml、
150ml和180ml装液量，共5瓶，121℃灭菌30min备用。
（2）将大肠杆菌按5%的接种量（种子液预先培养）接种上述培养基。 （3）将接种好的三角瓶置于200r/min的37℃摇床上培养8h。
（4）从不同装液量的摇瓶中取样，用721分光光度计测定其OD600的值，根据其浊度的大小可以判断微生物的生长情况，从而确定大肠杆菌在好氧培养时对氧气的需要量。 2 温度条件对微生物生长的影响
（1）将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装至试管中，4ml／管，共12管，121℃灭菌30min备用。
（2）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌按1%接种量接种液体试管培养基，每个菌种接种4管，分别标上20℃、28℃、37℃、45℃标记。
（3）按标记，将各试管置于相应温度的摇床中培养20h，转速为180r/min。
(4) 取出观察各菌的生长情况，并测OD600的值，确定每种微生物生长的最佳生长温度。 3 pH对微生物生长的影响
（1）将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装至试管中，4ml／管，共12管，121℃灭菌30min备用。
（2）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌按1%接种量接种液体试管培养基，每个菌种接种4管，分别标上pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0标记。
（3）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌分别置于37℃、28℃和37℃的摇床中培养20h,转速为180r/min。
（4）取出观察各菌的生长情况，并测OD600，确定每种微生物的最佳生长pH。 （二）微生物的耐盐性
（1）在无碳无氮基础盐培养基中加入葡萄糖和硫酸铵，配置基础盐培养基，并加入NaCl,分别配置终浓度为0.2、0.5、1、2mol/L的含盐培养基。并分装试管。每个浓度梯度配9管，121℃灭菌，备用。灭菌后测pH，保证pH不低于7.0。
（2）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌斜面种用生理盐水悬浮，分别按1%的接种量接种至不同盐浓度培养基中。每个梯度3个重复。
（3）将大肠杆菌、枯草的和芽孢杆菌、盐杆菌分别置于37℃、28℃和37℃的摇床中培养20h,转速为180r/min。
（4）取出观察各菌的生长情况，并测OD600，确定每种微生物的最高耐盐能力。 五、实验结果和报告
以柱状图形式记录上述环境因子对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌的影响。 六、问题与思考
1记录不同条件下大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌的生长情况。 2试从理论和实践上说明环境条件对微生物的影响。
第二篇 应 用 性 实 验
实验一、乳酸发酵与乳酸菌饮料
一、实验目的
1学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法． 2从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化 3乳酸发酵及检测。 4乳酸菌饮料制作。 5自制乳酸质量品尝。 二、实验材料
1嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌。
2 BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管、脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙。
3恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200-280ml)、培养皿、试管、300mL三角瓶。 三、 实验方法和步骤 (一)乳酸菌的分离纯化
1分离：取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5，取其中的10-4、10-52个稀释度的稀释液各0.1-0.2mL，分别接人BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环沾取原液平扳划线分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2鉴别：选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 (二)乳酸发酵及检测
1发酵：在无菌操作下将分离的1株乳酸菌接种于装有300mL乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，40-42℃静止培养。
2检测：为了使于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每6-8h取样分析，测定PH值；另一组在接种培养24h后每瓶加入CaCO3 (以防止发酵液过酸使菌种死亡)，每6-8h取样，测定乳酸含量，记录测定结果。 (三)乳酸菌饮料的制作
1将脱脂乳和水以1:7-10(W／V)的比例，同时加入5％-6％蔗糖，充分混合，于80-85℃灭菌10-15min，然后冷却至35-40℃，作为制作饮料的培养基质。
2将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2％-5％的接种量分别接人以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3-5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。
3把接种后的酸乳瓶置于40-42℃恒温箱中培养3-4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4-5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH 4-4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。
4以品尝为标被评定酸乳质量，采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳，品尝时若出现异昧，表明酸乳污染了杂菌。 四、实验结果和报告
1在BCG牛乳培养基琼脂平板上乳酸菌的黄色菌落典型特征和镜检细胞学特征。 2已发酵的乳酸菌饮料凝乳情况观察。 3乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。 4将发酵的酸乳品评结果记录于表中。 五、问题和思考
1发酵酸乳为什么能引起凝乳？
2为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳? 3试设计一个从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌和制作乳酸菌饮料的程序。 六、注意事项
1采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型持征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
2制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风昧和良好口感。
3牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。 4作为卫生合格标淮还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保持6-7d。
实验二、固定化枯草芽孢杆菌连续发酵生产α淀粉酶
一、实验目的
1学习制备固定化微生物活细胞的方法。 2了解固定化活细胞发酵连续产酶的特性。
3使用固定化细胞及利用玻璃管硫化床反应器连续发酵生产α淀粉酶。 二、实验材料