哚试剂后切勿摇动试管以免破坏乙醚层而影响结果。
4在糖发酵试验的培养管中装入倒置杜氏小管时，注意防止小管内有残留气泡。灭菌时适当延长煮沸时间可除去管内气泡。
实验九 培养基的配制
一、实验目的
1学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤 2学会实验室灭菌锅的使用方法 二、实验材料
1牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。 2试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。 3 灭菌锅 三、实验方法
(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。 1称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3调PH：检测培养基的PH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
5分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。 6加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。
9摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜度的长度不超过试管总长度的1/2。
10无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内，备用。 (二) 高氏1号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4.3H2O0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.01g，琼脂l5-20g，水1000ml，pH 7.4-7.6。
1 称量和溶解：先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2 PH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 (三)马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
K2HPO4.3H2O1g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。
1称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需要的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1％的水溶液，
在1000ml培养液中加人以上孟加抗红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋自胨培养基配制。
3链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1％的溶液(配好的链霉素溶液保存扩-20℃)，在100mL培养基中加1％链霉素0.3mL，使每毫升培养基中含链霉素30ug。 四、实验结果和报告
记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 五、问题和思考
1配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查，
3试设计实验对饮料进行无菌检查。 六、演示
1培养基的分装方法。 2试管斜面的搁置方法 七、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调PH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
实验十 土壤的稀释、分离、纯化及无菌操作技术
一、实验目的和内容
1学习从上壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。 2用稀释法分离细菌、放线茵和霉菌。 3用平板划线法分离微生物。
4学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 二、实验材料
1金黄色葡萄球菌和普通变形菌斜面菌种。
2已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶。
3无菌培养皿12套、无菌EP管10支、土壤样品、天平、称量纸、药匙、试管架、记号笔、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul枪头、200ul枪头、20ul枪头。
4无菌水(49.5mL、带玻璃珠) 1瓶、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。
三、实验方法 (一)土壤稀释分离
1取土壤：取表层以下5-10ml处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。 2制备稀释液
(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒人带玻璃珠的无菌水瓶中，振荡5-10min,使土壤充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2)梯度稀释：用移液器吸10-2的土壤悬液100ul，放入装有900ul无菌水的EP管中，上下颠倒数次，即为10-3的稀释液，如此重复，可依次制成10-3-10-8的稀释液。 注意：每一个稀释度换用一支枪头。 3混菌法测定菌落数的方法
(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各400ul，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒人以上培养皿中(装量以铺满皿底的2／3为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿平皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作。 (2)放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10％酚液50ul，摇匀，静置片到，然后分别从两管中吸出400ul加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。
(3)霉菌：取10-2、10-3两管稀释液各400ul，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释险接两个平皿。在熔好的土豆蔗糖培养基中，每1000ul加入灭菌的乳酸10ul，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。
4培养：将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28-30℃中温培养，细菌培养1-2d，放线菌培养5-7d，霉菌培养3-5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。 (二)平板划线分离微生物
1倒平板：按无菌操作要求，在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50℃)，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。
2划线分离：使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落。 3培养：方法同“土壤稀释分离” (三)斜面接种和穿刺接种 1斜面接种
（1）取新鲜斜面固体培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），
然后用无菌操作方法，把持接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。
（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。 (3)接种后30℃恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。 2穿刺接种
(1)取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)。分别接入金黄色葡萄球菌和普通变形菌。
(2)接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种．然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透)、然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。 (3)接种后30℃恒温培养，24h后观察，比较两种菌的生长结果。 四、实验结果和报告
1记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线曲和霉菌的数量。 计算方法：选择长出菌落数30-300之间的培养皿进行计数，技以下公式： 总个数／g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数x稀释倍数 2分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。 3比较两种细雨穿刺按种的结果，并进行分析。 五、问题和思考
1在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法? 2试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。
3试设计实验，从水或者空气中分离微生物，并进行计数。六、注意事项 1一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。
2在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 3放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
实验十一 厌氧微生物的培养
一、实验目的
1 学习培养厌氧微生物的方法，了解厌氧微生物生长的特性。 2 掌握深层穿刺法厌氧培养丙酮丁醇梭菌的操作。 3掌握厌氧法培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。 二、实验材料
1丙酮丁醇梭菌、产气荚膜梭菌。