1 枯草芽孢杆菌。
2 产淀粉酶种子培养液、产淀粉酶发酵培养液、4%海藻酸钠溶液、0.05mol/LCaCl水溶液、0.2mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0）、无菌生理盐水（0.85%NaCl）。
3 玻璃管流化床反应器(直径3cm，高20 cm，管外套加循环水套)、空气滤器、空气流量计、恒流泵、磁力搅拌器、5L发酵罐、水浴锅、500mL三角瓶、试管、比色用带孔白瓷板。 三、实验方法和步骤
1菌体准备
在无菌操作条件下，将灭菌的种子培养液按每瓶100mL分装于500mL三角瓶中，将活化的枯草芽孢杆菌α淀粉酶菌株接种于以上培养液中，37℃120r／min振荡培养16h作菌种。按10％的接种量接种于装有无菌发酵培养基的5L发酵罐中。维持37℃搅拌培养至对数生长后期(约24h)，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次。将收集的菌糊用生理盐水以10g／100mL制成菌悬液。
2固定化细胞的制备
在37℃条件下，将菌悬液与经115℃灭菌30min的4％海藻酸钠溶液等体积混合，放在磁力搅拌器上保持低速搅拌。以细塑胶管连接恒流泵和菌体-海藻酸钠悬液，在恒流泵的输送下，菌体-海藻酸钠悬液经直径为2-3mm的玻璃滴管滴入低速而连续磁力搅拌的0.05mol/LCaCl水溶液中，然后转入4℃冰箱过夜。取出后经无菌生理盐水洗涤2次，制成直径约1mm的固定化枯草芽孢杆菌细胞胶珠，菌体包埋在海藻酸钙凝胶中，即制成固定化细胞。
3固定化细胞连续发酵生产α淀粉酶
先将玻璃管流化床反应器灭菌，然后在进气口连接空气流量计和空气过滤器。在水循环外套的入口处连接水浴锅和温水循环装置，使固定化细胞反应器温度维持在37℃。在玻璃管流化床反应器内装入70g固定化细胞胶珠。开启恒流泵后，发酵培养液便流加进入反应器，反应器中供给无菌空气。培养后的发酵液由反应器顶部流出，收集发酵液，于4℃冰箱保存，用于测定α淀粉酶活性。
4 α淀粉酶活性测定
对收集的发酵液，可直接进行α淀粉酶活性测定，也可经超滤浓缩5-10倍后测定浓缩液的酶活性。α淀粉酶活性测定程序如下：
（1）吸取1mL标准糊精液，转入装有3mL标准碘液的试管中，以此作为比色的标准管(或者吸取2mL转入比色用白瓷板的空穴内，作为比色标准)。
（2）在25 x 20cm试管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加PH 5.0的柠檬酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL酶液，立即计时并充分混匀。定时取出1mL反应液于预先盛有比色稀碘液的试管内(或取出0.5mL加至预先盛有比包稀碘液的白磁板空穴内)，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙色，与标准色相同时，即为反应终点，记录时间。以
末发酵的培养液作为测定酶活性的空白对照液。
（3）计算淀粉酶活力
酶活力/U.mL-1=(60/t×20×20%×n)÷0.5
式中t为反应时间，n为酶稀释倍数，0.5是使用的酶液量（mL）。 四、实验结果和报告
1记录所收集发酵液的α淀粉酶活性，并根据测定结果阐述固定化细胞的产酶特点。 2试说明两粒包埋胶珠的平板活细胞计数结果及光学显微镜的观察结果。
五、问题和思考
1制备固定化细胞的操作中，重点应掌握哪几个技术环节?此法最适用于那类酶的生产， 2结合本实验学到的知识，试绘出利用固定化细胞连续生产胞外酶的流程图，并标明各部位。 六、注意事项
1将菌体-海藻酸钠悬液滴入CaCl溶液中时要逐滴滴入，不要连成线状，对CaCl溶液要低速轻轻的磁力搅拌，以形成均匀的胶珠。
2要控制培养基中磷酸盐的浓度，防止过高。流加的培养基要保持—定浓度的钙离子，以维持海藻酸钙凝胶的稳定性。
3测定α淀粉酶活性的可溶性淀粉和标准糊精液，要低温保存，注意防腐，其标准管应做到当天使用当天配制，并注意防腐和冰箱低温保存。
第三部分 综 合 性 实 验
微 生 物 的 诱 变 育 种
一、实验目的
以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 二、实验材料
1米曲霉斜面菌种。
2豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5％酪蛋白。
3三角瓶(250mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、实验方法和步骤
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备
l出发菌株的选择：可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。 2菌悬液制备：取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3-5d活化。然后把孢子洗至装有100mL0.1mol/L PH 6.0的磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬液，调其浓度为106-108个／mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理
可用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1紫外线处理：打开紫外灯(30w)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射1min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间。照射时间分别为15s、30s、1min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1-2h，然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2稀释菌悬液：按10倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.1mL加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2-3d。 (三)优良菌株的筛选
1初筛：首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40-50个，作为复筛菌株。
2平板复筛：分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至
周边分成8等份，1-7份中点种初筛菌株，第8份点种原始菌株，作为对照。培养48h后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进入摇瓶复筛阶段。
3摇瓶复筛：将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是：称取麦麸85g，豆饼粉(或面粉)15g，加水95-110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜，于500mL三角瓶中装入15-20g(料厚为1-1.5cm)，12l℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24-48h，共培养3-5d后检测蛋白酶活性。 4蛋白酶的测定方法
(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL或200mL)，40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取1g培养物于105℃烘干测定含水量。
(2)酶活性测定：30℃pH 75条件下水解酪蛋白(底物为0.5％酪蛋白)，每分钟产酪氨酸1ug为一个酶活力单位。计算公式为：
(A样品OD680值-A对照OD680值)×K×V／T×N K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数； V：酶促反应的总体积； t：酶促反应时间(min)； N：酶的稀释倍数。
5谷氨酸的检测：此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养基：豆饼粉：麸皮=6:4，润水75％，12l℃湿热灭菌30min。
谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水（W/V），40-45℃水浴，水解9d后过滤，以滤液检测谷氨酸含量（测压法） 四、实验报告
1试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。 2你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进? 五、问题和思考
1试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。 2为什么在诱变时要把菌悬液打散和培养一段时间? 六、注意事项
1紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。
2诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。