（一）直接方法
1． 检查抗原方法
这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。（图3-2-2）
图3-2-2 直接法
2． 检查抗体方法
将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。
（二）间接方法
1．检查抗体(夹心法)方法
此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
2．检查抗体方法
用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。
3．检查抗原法
此法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。同直接法相比荧光亮
度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。
（三）补体法
1．直接检查组织内免疫复合物方法
用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原-抗体-补体—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。
2．间接检查组织内抗原方法
常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-抗体-补体—荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。
（四）双重免疫荧光组织化学标记方法
在同一组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A和抗
的定位。
（五）对照试验
为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以下对照试验：
1．直接方法
（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。
（2）抑制试验：可分为二步方法和一步方法。
1）一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。
2）二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
（3）阳性对照：用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。
结果：如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
2．间接方法
（1）自发荧光对照：同直接法。
（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
（3）抑制试验：同直接法。
（4）阳性对照：同直接法。
结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。
3．补体方法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。
（6）阳性对照。
（1）~（5）结果阴性，6和待检标本阳性时，则为特异性荧光。三、荧光抗体的制备
制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一，制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原
荧光素和高效价的抗体。
（一）荧光素
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。目前主要常用于标记抗体的荧光色素如下：
1． 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）
FITC是一种呈黄色粉末状，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为389.4（。图3-2-3）
图3-2-3 FITC的分子结构式
在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键结合,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。
2．四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC)
TMRITC是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究(图3-2-4)。
3．得克萨斯红(texas red)
得克萨斯红是一种褐色粉末状，易溶于有机溶剂，性质稳定，在4℃下能保存2年以上，最大吸收光谱为590-595nm，最大发射光谱为620-630mm，共有四种结构，常用的分子量为625.15(图3-2-5)。
图3-2-4 TMRITC 的分子结构式 图3-2-5 Texas red的分子结构式
4． 其它荧光素
如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪(SITS) 7-氨基甲基香豆 素AMC呈兰色荧光；藻红素R(phycoerythrin-R)；花青(Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5,Cy7)等。
（二）荧光素标记抗体的方法
1．FITC标记抗体的方法
（1）Marsshall氏法
1）材料：抗体溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25-50ml) 、冰及冰槽(或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯(500ml)、pH7.2的0.01mol/L PBS葡聚糖凝胶G-25层析柱等。