2．盖玻片
盖玻片厚度在0．17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光又可激发标本。
3．标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，背景非特异染色引起的荧光影响判断。
4．封裱剂
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol／L,pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。如果用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有利于显微摄影。配方是将P—次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS 10m1中，调pH至9.0～9.5，再加入甘油90ml，混匀，在室温放置过夜，待其中小气泡完全消失即可使用。
5．镜油 ，按直接方法进行染色。 （2）二步法双染色方法 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油可用甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。对于落射光荧光显微镜BX60，Nikon E-1000无须镜油。
（三）使用荧光显微镜注意事项
1．严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
2．应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
3．防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。
4．检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；所以最多不得超过2~3h。
5．荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
6．标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
7．荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“—”——无或可见微弱自发荧光。“+”——仅能见明确可见的荧光。“++”——可见有明亮的荧光。“+++”——可见耀眼的荧光。
（四）荧光图像的记录方法
荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察，作为一般定性观察，基本上是可靠的。随着技术科学的发展，采用细胞分光光度计，流式细胞仪，激光共聚焦显微镜和图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。
荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易减弱褪色，要及时摄影记录结果。方法与普通显微镜摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24o以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度就有降低。有的荧光强度不够，曝光速度太慢，只能用人工掌握曝光时间，将荧光图像拍摄下来。研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微数码相机摄影系统装置，如Nikon公司2001年在我国推出了Nikon E-1000 全自动荧光显微镜配备有Cool CCD与计算机联接将图像采集在软盘上再与彩色打印机连接直接打印照片。
六、非特异性染色的消除方法
（一）非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分以下几点：
1．一部分荧光素未与抗体结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特异性染色。
2．抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。
3．除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗原结合。
4．从组织中难以提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易
混淆。
5．抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
6．荧光素不纯，标本固定不当等。
（二）消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
1．透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光抗体液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸人0.01mol／L pH7.2的PBS中(悬于大于标记物体积约50—100倍的PBS内)，在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，透析液中无荧光即可(在荧光光源照射下)。
2．葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除去游离荧光素可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析方法，加入荧光抗体15～18ml(按床体积的5％～10％加样)，使其缓慢渗人柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30—40min，使游离荧光素充分进入分子筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的距离界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分，收集中间部分，测F／P比值，合格者浓缩，分装。如仅用小量荧光抗体，可用1cm×20cm的层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
3. 荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体的特异性染色与非特异性染色效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
4. 纯化抗原方法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。现代免疫化学技术(免疫吸收法)和柱层析法等提供了很大的可能性。
5．伊文蓝（Evan blue）衬染色方法
用0.01%伊文蓝的0.01mol/L pH7.2 PBS溶液稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文蓝一般配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以稀释荧光抗体。