2）方法及步骤：
①抗体的准备：取适量已知抗体浓度之溶液，加入三角烧瓶中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后抗体浓度为20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
②荧光素的准备：根据标记的抗体总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
③结合：边搅拌边将称取的荧光素渐渐加入抗体溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上(大约在5~10min内加完)，加完后，在4℃左右继续搅拌12~18h，通常将装置安放4℃冰箱或冰库中进行。 ④透析：结合完毕后，将标记的抗体溶液离心(2000r/min)10min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中用0.01M pH7.2缓冲盐水透析(0~4℃)过夜。
⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。（图3-2-6，图3-2-7）
图3-2-6 Sephadex G-25
对FITC标记抗
体液(羊抗兔)柱
层析洗脱模型
图3-2-7 FITC 与家兔IgG球
蛋白在25℃和2℃时结合
的动力学 ( Kawamura
1964)
（2）Chadwick氏法
1）试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶(25ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋、棉线、玻棒等。
2）方法及步骤：
①抗体准备：用0~4℃的pH 8.0磷酸盐缓冲盐水将抗体蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml， 置入三角烧瓶内，放于冰槽中。
②荧光素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。 ③将准备的抗体与荧光素溶液等量混合，充分搅匀，在0~4℃冰箱中结合18~24h。
④透析和柱层析：方法同Marshall氏法。
（3）改良法
试剂：
1）0.01mol/L pH7.2PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2g，溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。
2）0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol/L Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/L NaHCO3(4.2%)90ml，混匀后，校定pH至9.0。
3）3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
方法及步骤：取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0.15mol/L NaCI)及缓冲液(0.5mol/L NaHCO3-Na2CO3 pH 9.0)稀释使每ml内含抗体10mg，缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸荧光素，(蛋白：荧光素=80mg:1mg)，在0~4℃下电磁搅拌12~14h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler氏试剂测验至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%，分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20保存可达2年以上。
2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
（1）取IgG10ml(6mg/ml)在0.1mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。
（2）将四甲基异硫氰酸罗达明(每毫克IgG 加入5~20 g)溶于二甲亚砜(1mg/ml)，取此溶液300 l,一滴一滴加入抗体溶液中，同时电磁搅拌。
（3）在室温中搅拌2h，避光。
（4）把结合物移入直径3cm，高30cm大小的Bio-Gel P-6层析柱，用0.01mol/L pH 8.0的PBS平衡过柱，流速为1.5ml/min。
（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。
3．藻红蛋白标记抗体方法
（1）巯基化藻红蛋白(phycoerthrin,PE)的制备 600μl的15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺(iminothiolane hydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB(pH 6.8)混合，装入透析袋置入50mmol/L pH
6.8 PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5 PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。
（2）巯基PE-IgG制备 异双功能试剂SPDP[N-Succinimdyl 3-(2-pyridyldithio) propionate] 30 g (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液(50mmol/L pH 7.5)，在室温中反应2.5h。再加入巯基化
PE400μl(1.7mg/ml)加到500μl反应混合液中，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，在4℃用PB透析过夜。加入 0.01%NaN3分装，4℃保存半年。
（3）PE-标记蛋白A方法
1）取4.08mg PE 溶于0.1mol/L pH 7.4 PB(含0.1mol/L NaCl)1ml中，溶解后， 取出0.5ml，再加入10μl SPDP无水甲醇液(2.6mg/ml)，SPDP/蛋白摩尔比为10, 22℃反应5min，过Sephadex G-50(1×17cm)，用100mmol/L pH 7.4PBS(含0.1mol/L NaCl)平衡和洗脱。
2）0.5ml蛋白(2mg/ml)100mmol/L PBS(含有100mmol/L NaCl pH 7.4)，加入2.6μl上述SPDP甲醇液， SPDP：蛋白A=9：5 ，22℃，40min, 加入25μl二硫苏糖醇(DTT) pH 7.4缓冲液，22℃，25min，同上过sephadex G-25，收集蛋白A峰。
3）取0.77mg/ml的PE 和0.27mg/ml蛋白A 等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol/L pH 7.4 PB(含有0.1mol/L EDTA、1mol/L 碘乙酰胺、1% BAS和0.1% NaN3)，0~4℃保存。
4．蓝色荧光素标记抗体方法
Kbaffan 等(1986)首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。
（1）取7-氨基-甲基香豆素(7-amino-4-methyl coumarin,AMC)260μg溶于二甲亚砜25μl中。
（2）将上液加入10ml IgG- 巴比妥缓冲液(0.5mol/L, pH 8.5,内含50~100mg IgG)中，室温反应2h，过Sephadex G-50除去游离荧光素, 最大荧光波长430nm, 最大吸收波长354nm。
（三）荧光抗体的质量控制
1．染色特异性和敏感性的测定方法
（1）特异性染色和效价测定 直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如1：2，1：4，1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大稀释度，为其染色滴度(效价)或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度(即2~4个单位)，如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。
（2）非特异性染色测定 根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。