（3）吸收试验 在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜，3000r/min,离心30min，收集上清液，再用于相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。
2．F/P比值的测定方法
F(荧光素)和P(抗体蛋白)的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1~2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。
（1）蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。
（2）结合荧光素定量 先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg，溶于10ml 0.5mol/L pH 9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/L pH 7.2 PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横座标，作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm，FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。
F/P比值的计算：可按以下公式计算。
FITC g/ml 160000×103 FITC g/ml
F/P克分子比值= ——————— × —————— = 0.41×
蛋白质 mg/ml 390×106 蛋白质mg/ml
式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧
光素从克换算为微克需要再乘以106。
测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：
(RB200 g/ml×10-3) ÷580
RB200荧光抗体的克分子比值= ¬¬—————————————
蛋白质mg/ml÷160000(IgG)
A515nmOD 160000
TMRITC荧光抗体克分子量比值= ———— 或=重量比(g/g) × ————
A280nmOD 580
3．荧光抗体的保存
以0~4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为1：5000的硫柳汞或者1：10000，叠氮纳防腐，小量分装如0.1~1ml，真空干燥后更易长期保存。四、免疫荧光组织化学染色方法
（一）标本制作
（二）荧光抗体染色方法
1． 直接方法
（1）染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体，在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
（2）洗片 倾去荧光抗体，将切片浸入pH 7.2PBS中洗两次，电磁振动，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
（3）50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.0~9.5)甘油封固、镜检。
直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
2．间接方法(双层法)
（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH 7.2PBS洗两次，10min，用吸水纸吸去多余的液体。
（2）再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等)，同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，振动，缓冲甘油封固，镜检。
3．间接方法 (夹心法)
（1）切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
（2）滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
（3）缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
（4）滴加特异性荧光抗体在切片上37℃，30min。
（5）如（3）水洗。
（6）缓冲甘油封固，镜检。
4．补体方法
（1）材料和试剂
1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价如为1：32则免疫血清应用1：8稀释。
2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4的0.1mol/LPBS中溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋
白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
（2）方法步骤
1）涂片或冰冻切片用冷丙酮10min固定和PBS洗一次，3min，吹至组织表面无水份。
2）吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液(此时免疫血清及补体又都各稀释一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。
3）用缓冲盐水洗2次，搅拌或振动，每次5min，吸干标本周围水份。
4）滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同(3)。
5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。
5．膜抗原荧光抗体染色方法
本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此原理和方法。
6．双重染色方法
在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：
（1）一步法双染色方法 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+
接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。
（三）荧光抗原染色方法
某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接方法。由于多数抗原难以提纯或量少昂贵，一般很少采用此法。五、荧光显微镜检查方法
（一）荧光显微镜
荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具，分透谢和落射二种类型，落射光无需镜内操作方便，效果更好。它是由超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
（二）荧光显微镜标本制作要求
1．载玻片
载玻片厚度应在0.8-1.2mm之间，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。