性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
三、试剂的准备
（一）诱导细胞模型药物储液的配制及原则
详细阅读药物说明书，熟悉药物的溶解度和溶剂，掌握最大溶解度和储存温度和药物溶解前后的有效期。
如果药物包装小于或等于5mg，不进行电子天平的称重，直接在无菌条件下用相应的溶剂溶解，其原则：
(1)配制药物储存液时，既要考虑药物实验浓度的要求、可稀释性和可取体积的准确性，还要考虑药物最大溶解度，以利于溶解后的药物保存时间更长。一般情况下，药物储存液浓度越大其保存时间就越长。 (2)根据说明书选择药物的溶剂，如果可供选择的溶剂有多种，最好选择水溶剂（可用0.22μm滤器除菌后分装），其次是不容易挥发性的溶剂，再其次对细胞毒性小的溶剂。
(3)配制药物储存液时，要在生物安全柜或净化工作台中进行溶解和分装。有些药物溶解较慢，要等待药物溶液澄清才认定为充分溶解 (4)药物包装比较大，需要称量部分药物，请严格按照《BT224S型Sartorius电子分析天平称量微量药品的操作规程》执行。 (5)药物在运输过程中，使得部分药粉黏贴在包装瓶壁或盖上，在加入溶剂溶解时，充分考虑到这些问题，以保证药物浓度的准确性。 (6)要根据预实验和正式试验的药物需要量，进行药物储存液的分装，一般略多于实际应用量。如一次实验用药物储存液10μl，分装时，每
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管至少要分装体积12μl.。
(7)每次试验如果有剩余的药物储存液，应根据药物物理化学特性，决定是否可再次使用。一般情况下不能再次冻融。所以实验后剩余的药物储存液一般应该弃掉。
(8)严格药物要求的保存温度和有效期，实验用药物储存液一定在药物有效期内使用，超过有效期的诱导剂或干预药物储存液绝不再用。 (9)药物分装后，都要包裹锡箔纸以避光保存。在锡箔纸外包裹标签，标明药物名称，摩尔浓度，分装日期和分装的体积/管。
(10)配制药物储存液的量要根据实验的次数，用量的要求配制，以免实验结束还有很多药物没有用完，造成浪费。也要避免配制的药物储存液不够，而造成实验中途配制药物储存液，而造成批次实验的条件不一致。
(11)实验加药时，防止药物溶剂的挥发。因此，要尽可能在准确吸取药物同时，缩短取药时间，并在每次取药液后及时盖严瓶盖。 (12)实验加药取药原则按照《微量加样器使用一般原则》执行，见附件7。
（二）药物浓度的计算和换算方法
实验工作中，试剂配制是一项重要内容。工作人员必须熟练掌握配制方法、规程和要领；对于某些常用特殊试剂，也应了解试剂的理化性质、实验中的反应原理和配成后的质量性能，然后按照操作规程认真配制。不正规的配制方法，常有很大的误差，如出现混浊、沉淀、变色而失效或者配制中途失效，甚至有时还发生危险事故。特别是实验
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室的基准溶液、标准试剂等，如配制不当，则导致试验结果的系统误差。常用溶液浓度公式及配制（见附件11） 1.常用试剂的配制方法
（1） 标准溶液 凡是用来配制标准溶液的物质必须具备以下条件： ①易于制纯、烘干，应符合GR 或 AR 品级者。 ②易于保存，配制后的溶液浓度稳定不变。
③使用中能按反应方程式所表示的结果进行，不得有副反应发生。 配制标准溶液时，取符合以上条件的物质，进行恒重后，直接称取规定的重量溶解在定量的溶剂中使用。
（2） 一般溶液：凡不是标准溶液，又不要求严格控制浓度的试剂，可直接配制。根据要求可用实验天平，扭力天平，分析天平称重，玻璃量器可用量筒或容量瓶。 2．间接配制法
有些不易恒重的固体或含量不准的液体试剂，在需要配成浓度准确的标准溶液时， 可采用间接配制法，即先配成近似浓度的溶液，再用标准液标定其准确的浓度。如酸碱溶液、高锰酸钾溶液、硫代硫酸钠溶液的配制等。 3.常用试剂配制的要点
（1）以固体溶质配制试剂，一般都用称重法。首先选取合格的溶质，必要时先进行烘烤处理。然后在分析天平上称取规定的重量 （配制标准溶液，十万分之一天平最小称重显示值0.1mg），放在洁净的烧杯中，加入适量溶剂溶解，如果溶质较难溶，可适当加热助溶；如果试剂为有机溶剂，欲加热助溶则需隔水加热。待完全溶解置室温待冷，倒入
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容量瓶中，然后以溶剂补至接近刻度，待冷至20℃，再以溶剂补足至刻度，混合均匀，倒入试剂瓶中加塞保存备用，如果称量溶质量较小（mg），严格按照《BT224S型Sartorius电子分析天平称量微量药品的操作规程》执行。
（2）以流体溶质配制试剂，除特殊要求外，一般均用容量法，先取适量溶剂（约全量的一半）放入烧杯中，再量取规定量的溶质，并缓缓加入溶剂内，必要时需边加边搅拌均匀，然后倒入容量瓶内，再以溶剂补足至刻度，混合均匀，倒入试剂瓶中，密塞保存备用。 （3）某些试剂在配制过程中产生高热，配制时应缓缓操作，并且不断搅拌，必要时需设法降温。配制成以后放室温冷却，待温度降到20℃左右，再倒入容量瓶，以溶剂补足至刻度，然后倒入试剂瓶保存备用。 （4）对于一些在配制过程中产生一系列化学反应的试剂，必须首先了解它的反应原理（目的），掌握它的关键要领，并严格按照操作规程进行操作，才能取得满意结果。
第三部分 细胞培养操作技术
细胞培养技术是细胞模型建立的关键技术，为更好的操作细胞，我们对常用的细胞分别撰写了细胞的冻存，复苏和传代的操作规程，有关特殊细胞应用的培养体系谨遵所用细胞的冻存，复苏和传代操作规程执行。
一、贴壁细胞系的传代和培养 (一)传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台面及 四壁和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯或红外灭菌器：如果用酒精灯，注意火焰不能太小（不得小于1公分高度）
5.取出已经预热好的培养用液，用75%酒精纱布擦拭后方能
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放入超净台内。
6.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精纱布擦拭显微镜的台面，再观察细胞。
7.将各瓶口一一打开，同时将瓶口在酒精灯火上或红外灭菌器灼烧消毒。
（二）胰蛋白酶消化；
1.选择融合率长达80%左右的细胞进行传代；
先用PBS洗2次；加入消化液：小心吸出培养液，并移入到一50ml锥形离心管中，用PBS清洗（25cm2培养瓶用5ml冲洗，75cm2培养瓶用10ml冲洗），洗掉更多的血清，用滴管将PBS洗液移入同一50ml锥形离心管中（注意吸净PBS），加入适量0.25%胰蛋白酶消化液（25cm2培养瓶用1ml，75 cm2培养瓶用2ml），注意消化液要全部覆盖单层细胞，置37℃培养箱中消化。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度（一般3～5min）。 3.将50ml锥形离心管中的培养液加入培养瓶中，终止消化。 4.用弯头滴管将细胞吹打成单个细胞悬液。 5.将细胞悬液移入50ml离心管中。 6. 离心1500转/分钟 离心5分钟。
7.弃去上清液，轻叩管底，使细胞松散，加入10ml 10%小牛血清1640，用滴管轻轻吹打细胞制成单细胞悬。 （三）传代细胞：
1.取100μl左右体积的细胞悬液，行台盼蓝拒染计数。根据细胞操作规程要求的细胞传代密度传代细胞。
2.注意密度过小会影响传代细胞的生长。最后要做好标记。 3.用酒精纱布擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
注：有的细胞需要胰蛋白酶与EDTA混合消化。EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方见附件1。
二、悬浮细胞系的传代和培养 （一）传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台面及四壁和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且 减少污染。
4.点燃酒精灯或红外灭菌器，红外灭菌器使用按《HOPE-MED 8073A型 红外线灭菌器操作规程》执行。如果使用酒精灯，注意火焰不能太小（不
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