细胞模型的稳定性受多种因素的影响。主要与细胞模型建立的实验设计和实验设计依据、所用的细胞状态、细胞接种密度、培养体系的选择、药品加入的准确性以及培养条件的稳定性等因素有直接关系。因此要严格把握每个环节的精确性、科学性，避免任一环节的错误造成实验模型的失败。
（一）细胞膜型建立及实验设计内容范文
根据实验目的不同，建立的细胞模型就不同，所进行的实验设计就不同。细胞模型建立的实验设计内容包括：（1）实验的目的和意义；（2）实验所用的细胞；（3）预实验和正式实验所用的材料和试剂准备；（4）细胞状态的选择和细胞活力要求；（5）实验的分组；（6）诱导细胞模型的药物浓度和时间、评价方法和指标。（7）建立细胞模型实验设计范文：
（二）范文（见附件13）：
（三）细胞模型建立的培养体系要求 1.所用细胞的状态
细胞首先处于指数生长期，细胞大小均一，折光性好，细胞质均匀细腻，无粗大颗粒，细胞培养液中无细胞碎片。贴壁细胞融合率处于80%左右，特殊要求的细胞融合率在70%左右适合做细胞模型。 2.细胞的活力
用0.4%台盼蓝染色，细胞拒染率98%以上方可用于细胞模型建立，如果细胞台盼蓝拒染率在97%时，要综合考虑细胞的形态，细胞融合率和细胞的折光性及细胞生长的密度是否适合进行细胞模型建立。如果拒染率低于97%则放弃做细胞模型诱导实验和细胞模型干预实验。
细胞计数时确保重悬细胞的体积的精确性、确保细胞处于单个细胞分散状态，细胞混悬要轻柔而充分，取出计数的细胞悬液要代表细胞总体分布的状态。计数的细胞悬液调整到5～10×105细胞/ml范围内，否则计数的细胞结果不准确。 3.细胞的接种密度
细胞接种密度是指建立细胞模型时，初始接种的每毫升细胞的个数（C×10N/ml，C代表阿拉伯数字，N代表幂次，如1×106/ml）。细胞接种密度直接影响细胞模型建立成功与否，细胞接种密度取决于细胞种类、细胞生长特性（悬浮、贴壁和半贴壁生长）、细胞的群体倍增时间、培养体系和实验结果终止的时间要求。群体倍增时间在24小时的半贴壁细胞（如Dami细胞），实验终止的时间是72小时时，其培养终体积10ml的培养体系中，可调整细胞的初始接种密度为2～3×105/ml，每10ml培养体系中加入1ml 2～3×106/ml的细胞，细胞终密度为2～3×105/ml。 4.实验分组
实验分组要素：（1）对照组：细胞对照组、诱导药物溶剂对照组、不
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同药物浓度和药物作用时间对细胞影响的对照；（2）实验组：时效实验组设置、浓度依赖组设置、诱导模型药物及干预药物配伍设置； 5. 培养基
培养基种类很多，我们最常用的是RPMI-1640培养基。
RPMI-1640培养基（Roswell Park Memorial Institute,洛斯维公园纪念研究所。 RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号）。
培养基在配制前要核对是否储存在4℃、避光以及在保质期内，只有符合这些条件的培养基才能用于细胞培养。配制好的RPMI-1640培养液存放在-20℃，用于细胞培养时，可室温溶化，4℃保存，有效期15天，如超过15天需要向培养液中添加足量的谷氨酰胺（每100mL培养基中加200mmol/L的谷氨酰胺储存液1ml）。 （1）配制培养基的原则
培养基大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。配制培养基的水的电阻应为18MΩ（兆欧)时才可应用。
我们实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌滤器滤过处理。分装在500ml输液瓶中，每瓶350～400ml，-20℃存放1年。培养基具体配制方法见附件12。
注意：-20℃保存的培养液，一旦融化后出现沉淀，该培养基不能用于细胞培养。
（2）小牛血清：
我们使用的小牛血清，均经过筛选的优质小牛血清，较好的支持细胞生长。
小牛血清为四季青公司的产品， 200ml/瓶包装，储存在-20℃。用前应放在4℃过夜缓慢融化（防止快速融化出现沉淀），再进行分装成50ml/管，4℃存放（一个月）。 （3）完全RPMI-1640培养基的配制
每次更换细胞培养液，都要现用现配制完全RPMI-1640培养基（10%小牛血清RPMI-1640培养基）。不得预先配好放在4℃备用。 操作方法：
材料：75cm2培养瓶；10ml刻度移液管；电动辅助移液器；小牛血清；RPMI-1640
取RPMI-1640培养液90ml加入到75cm2培养瓶内（或其他无菌容器内），加入小牛血清10ml，用刻度移液管反复吸打混匀，注意不要吸打更多的泡沫生成。使成完全RPMI-1640培养基。 6. 新生牛血清的筛选 实验原理
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牛血清是细胞培养基中的重要成份之一。在培养基中加入适量血清(10%)，首先可以补充细胞生长所需的生长因子、激素等，其次它具有解毒作用，能解除脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性；其次，它还能中止胰酶的作用，并保护细胞免受机械损伤等。但是血清成分复杂，不同来源、不同批号生产的血清对细胞生长作用的差异较大。血清的保存期只有一年，不同存放时期的血清的效力也不同。所以，当新购得的血清或要在开始一个重大试验的时候，应首先进行牛血清的筛选。 筛选时，通常选用正常的二倍体细胞和条件苛刻的肿瘤细胞，也可以使用正要准备培养的细胞。另外，用已知优质血清作对照。 （1） 仪器、材料和试剂
CO2 培养箱，超净工作台，微量加样器 96孔培养板，刻度吸管，移液管，试管，吸管，废液缸，血球计数板，HeLa细胞、Dami细胞或SP2/0细胞等。 RPMI-1640，不同批号的血清，胰酶 （2）实验步骤
①取HeLa细胞或Dami细胞，胰酶消化或直接吹打后，用无血清培养基重悬(避免以前血清的干扰)，计数。
②.用8道加样器取4000个（100μl，无血清培养基调整细胞密度4×104/ml）HeLa细胞或Dami细胞加入到每行的第一孔。第1孔至第12孔中都含有相应小牛血清（40%）RPMI-1640 100μl。依次用8道加样器（100μl）稀释下去，直到最后第12孔。 ③在A和H行加入标准血清的培养基。(对照组)
④.将第一孔中的液体（细胞悬液）100μl移入第二孔，从第二孔吸100μl移入第三孔，依次稀释下去。最后孔的100μl弃掉。这样就形成了由第一个孔到最后一个孔的细胞梯度从大约4000、2000、1000等至0.98～1个细胞。
⑤在B～G行采取同样的方法。不同的是，每行筛选的是不同批号的小牛血清。
⑥将96孔培养板放入CO2培养箱37℃培养～2周。
⑦培养结束后，观察细胞生长的情况。比较在同一细胞浓度下的不同血清对细胞生长的影响。在同一细胞浓度下细胞生长数量最多（或克隆数最多）的血清即可作为被选择的血清样品。如果不理想，需要厂家重新提供新批号血清再行筛选。 实验结果举例：
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从第五列开始计数，结果见下表 集落数 第5列 第6列 第7列 第8列 第9列 第10列 第11列 第12列 A 对照 B 22 12 03 03 01 00 00 00 C 42 17 04 05 01 01 02 00 D 15 04 04 00 00 00 00 00 E 14 07 00 03 02 00 01 00 F 25 10 09 03 00 00 00 00 G 24 15 00 01 00 00 00 00 H 对照 24
实验中，我们可以看出C组细胞的集落数是最多的(相对于同一列来说)。C组细胞的血清被选定，这说明该批号血清更能促进 HeLa细胞或Dami细胞的生长。值得注意的是，不同细胞可能适应不同的血清，不能一概而论。
实验讨论：本实验使得每一列或行的细胞总数的差异减到最小，从而使得系统误差减小；而且，这种方法方便快捷、优越和效率也有所提高。
方法二、有限稀释法 （1）仪器、材料和试剂
CO2 培养箱，超净工作台，微量加样器，96孔培养板，刻℃吸管，移液管，试管，吸管，废液缸，血球计数板，HeLa细胞、Dami细胞或SP2/0细胞，RPMI-1640，不同批号的血清，对照用优质小牛血清、胰酶（用于贴壁细胞） （2） 实验步骤
筛选用的细胞如果是贴壁细胞，先将培养基移到一50ml的离心管中，用PBS洗贴壁细胞2次，加入1ml 0.25%胰蛋白酶（25cm2培养瓶），37℃3～5min，镜下见细胞变圆，脱离瓶壁，加入原瓶培养基终止消化，用弯头滴管轻轻吹打（以下与悬浮细胞有限稀释法同），移入50ml的离心管中，离心1500rpm/min 5min，室温，弃上清，用10ml RPMI-1640洗两遍，去掉原来血清的干扰。将细胞悬液精确调整适当体积进行计数。将细胞用无血清RPMI-1640调整到10个细胞/ml。 96孔培养板，每孔加入调整好的细胞100μl（每孔大约1个细胞）。每批号血清至少要加24孔，然后加入40%筛选小牛血清RPMI-1640 100μl 。
对照组用现用的优质血清，用同样方法稀释。小牛血清终浓度为20%。 加完96孔板后，震荡混匀。放在湿盒中，7天开始观察，直到14天止，计数每孔中的克隆数和每个克隆的大小。
评价标准：只要有克隆生长，就认定是好的优质血清；克隆生长的越多就越好；都有克隆生长，以克隆大小评出更优质的小牛血清。有同样的克隆数目，但是克隆大者为更优质的小牛血清。 （四）可调微量加样器的使用及校正
细胞模型建立的稳定性和可调微量加样器使用正确与否关系密切，使用得当，模型建立稳定，结果可靠。如果使用不当则结果相反。出现结果跳跃，批次之间无规律可循。因此有必要对可调微量加样器的使用做一介绍。我们实验室常用的可调微量加样器（以下简称加样器）：1000μl、200μl、100μl、20μl、2.5μl和2μl几种规格。 1.加样器（移液器）使用的一般原则
加样器的使用离不开一次性的塑料吸头（枪头），尽管一次性塑料
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