分子量MW.292.24
292.24×0.5×0.05(L)=7.31g
称取7.31g EDTA，置于100ml烧杯中，加入20 ml双蒸馏水充分搅拌。用10M NaOH调节pH值至8.0（注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解），再加双蒸馏水定容至50ml。高压灭菌或过滤除菌，分装，室温保存。
注意： EDTA溶液应贮存于硬质玻璃瓶内，避免与橡皮塞接触。 附件2. 0.4%台盼蓝配制 台盼蓝粉剂 0.4g
PBS 加至100ml 4℃过夜溶解 新华滤纸过滤
分装：分装于青霉素小瓶中，每瓶5ml 保存：2～8℃保存数年 室温储存2年
附件3. 清洁液的配制方法
清洁液常用的配制方法是将浓硫酸(96％)缓缓加入到水中．这样不仅限制了配制的量．同时也增加了取酸的危险性。通过长期的工作实践．在配制清洁液的过程中．先加入少量的硫酸于水中(约为配制量的5％)后，再将此稀酸液加入到浓硫酸中去，具体方法如下： 处方：
重铬酸钾 800g. 水500ml．
96％浓硫酸加至10000ml。
取重铬酸钾加入到500ml水中加热使溶解．趁热缓缓加入500ml浓硫酸，随加随搅拌．待加完后，立即将此稀酸液加入到约9000ml的浓硫酸中．并随加随搅拌补充浓硫酸至10000m1即得。此种方法具有以下优点①由于配制的过程中需取用的酸量少(5％)．从而减少了取酸的危险和麻烦。②此法在配制后来见有重铬酸钾析出。③经应用与传统的将浓硫酸加入到水中的方法相比具有很强烈的氧化作用。 主要产生有强氧化作用的铬酐，从而达到去热原及去污作用。④盛酸的容器不需加热，可以缩短时间，而且可以一次性的大量配制 附件4.培养体系使用的注意事项：
1.培养基的储存条件是2～8℃。如果细胞培养基不小心被冻，应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀只能丢弃这些培养基。 2.储存在冰箱中的瓶口已经开启的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢钠导致了pH
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值的上升。可以在使用前松开瓶口，将培养基放置在CO2培养箱中培养10～15min，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 3.当在无血清培养基中添加抗生素时，血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能会对细胞达到毒性水平。
4.一旦在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，应该在两到三周内使用。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后开始降解。
5.部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数多会 引起一定水平的蛋白质降解和沉淀。
6.血清的灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究，培养ES细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤，并没有确凿证据说明这样做是有益的。相反，对大部分细胞而言，有些厂家不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加。
7.避免血清中沉淀的产生;(1)解冻血清时，按照所建议的步骤解冻法（-20℃至4℃至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20℃至37℃），非常容易产生沉淀物。（2）勿将血清放置37℃太久。血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。（3）血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无需作此步骤。（4）如必须做血清的灭活，要遵守56℃ 30min的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均，都会造成沉淀物的增多。 8.在进行传代培养时，要知道细胞的群体倍增时间，强烈推荐进行台盼蓝活性计数、固定传代时间和固定传代密度方法传代细胞。使得细胞生长状态保持均一。
9.储存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30min，就会变得不稳定。
10.在订购的细胞到达后，应立即复苏，如果培养基没有准备好，可将其放入液氮中，尽快复苏。绝不允许放置在-20℃或-80℃的冰箱中。 11.细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤，请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤，并仔细阅读。有些供应商就不推荐在复苏时离心，对此类细节，应该特别留意。国内的主要细胞库：ATCC(细胞株及胚胎干细胞库)
(1)下载细胞库目：http://www.atcc.org/pdf/tcl.pdf （2） 查询细胞株：
http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBio logy.cfm （3） 胚胎干细胞库：
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http://stemcells.stcc.org/products/cells.cfm （4） ECACC(European Collection of Cell Cultures) http://www.ecacc.org.uk/ （5） 中国科学院上海细胞库/干细胞库： http://www.cellbank.org.cn/ （6） 中国医学科学院基础医学研究所细胞中心（协和细胞库） http://sbm.pumc.edu.cn/xibaozhongxin/index.htm
附件5.细胞计数操作流程 1.（台盼蓝拒染法） 台盼蓝拒染法原理
细胞损伤或死亡时，台盼蓝染料可穿透死细胞膜，与DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞，不被着色。借此可以鉴别死细胞和活细胞。台盼蓝拒染法操作简单，是最常见的活细胞计数方法和活细胞活力检测方法。 2.血球计数器的结构和保养
血细胞计数板是由长方形无色厚玻璃制成，正面观察，可见中央刻有两个计数室平台，由“H”型沟槽相隔。与计数板长轴垂直的沟槽外侧各有一条与之平行的凸出的支持柱，用以承载血盖片，支持柱的外侧仍为与长轴垂直的沟槽。沿计数板长边侧面观察，可见支持柱略高于计数室平台（落差0.1mm），如将血盖片搭载于支柱上，盖片与计数室平台之间即形成0.1mm的缝隙。此时将液体充入盖片与计数室之间，则液层的厚度（或深度）也为0.1mm。
在显微镜下，可见每个计数室平台上均刻有清晰的网格划线。由网格线围成的正方形区域为细胞计数区，最大正方形边长3mm，分为9个大方格，每个大方格边长1mm，面积1mm2，若覆以盖片并充满液体，液体的体积为0.1mm3（0.1μl），四角的四个大方格分别以单划线分为16个方格，用作计数白细胞。位于中央的大方格，以双线分成25个中方格，每个中方格又以单线划分为16个小方格，则中央大方格共分为400个小方格。用作计数红细胞及血小板。划分中央大方格的划线向其四周延伸，则除四角大方格之外的四个大方格均为条形格所分隔。
覆盖计数室的盖玻片为专用的血盖片，长25 mm，宽20mm，厚0.6mm，透明、均匀一致。使用时，用水稍微沾湿计数室两侧的支持柱，以推压法将盖片平放在计数室表面，尽量减少盖片与支柱之间的空气。用吸管吸取制备后的细胞悬液，沿盖片与计数室之间的缝隙充入计数室。
质量控制：血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中
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由于操作人员操作不当，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filederror）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。 3.避免技术误差，纠正仪器误差
（1）所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。①计数板的鉴定：要求计数室的台面光滑、透明，划线清晰，计数室划线面积准确。必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数室的边长与底面积，用微米千分尺测量计数室的深度。美国国家标准局（NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即1±0.01mm，深度误差应小于2%，即0.1±0.002mm。若超过上述标准，应弃之不用。②血盖片应具有一定的重量，平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在9个点），不均匀度在0.002mm之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数室表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也符合要求。
（2）细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒。
（3）严格操作，从稀释、充池到计数都应规范，尤其应注意的是稀释及充池时既要作到充分混匀，又要防止剧烈震荡破坏细胞。必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边缘为宜。
4．缩小计数域误差或分布误差 由于细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson分布，而所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。Berkson指出，当使用同一支吸管、同一面计数室，计数0.2mm2面积的细胞数，有望将 CV控制在可接受的7%以内。 5.细胞计数
操作步骤：①取血细胞计数板和盖玻片，用70%酒精擦净，用绸布或擦镜纸轻轻擦干，将盖玻片放在计数板中央。②收集悬浮培养细胞，
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4℃ 1500rpm/min 5min离心,用无血清培养基（或PBS）洗1次，将细胞悬液定量稀释。③将1份台盼蓝溶液与1份细胞悬液混合，形成台盼蓝细胞混悬液。④吸取10-20μl混合均匀的台盼蓝细胞混悬液，滴加于计数板盖玻片的边缘，让液体借助虹吸作用自动进入盖玻片下方的计数池内。⑤滴加细胞悬液后静置1min，在100×显微镜下观察并分别计算出四角大格内的未染色的活细胞数和染为蓝色的死细胞数。
注意：由于划线部分也占有计数室的总面积，因此对压线细胞也应列入计数，为避免重复计数或漏计，一般遵循数上不数下，数左不数右的原则（图）。
将计数的活细胞数和死细胞数代入下列公式求得活细胞密度和细胞活力。
细胞密度=4个大格中活细胞总数/4×104×稀释倍数 活细胞%=活细胞数/细胞总数×100% 细胞总数 = 细胞密度×细胞悬液体积
台盼蓝拒染率 =（细胞总数-死细胞数）/细胞总数×100% 死细胞百分数（%）=死细胞数/细胞总数×100% 6.注意事项：
细胞经台盼蓝染色后，必须在3～5min内细胞计数完毕，更长时间的放置会导致细胞的死亡和减少活细胞的数量。
[1]待计数的细胞应该用PBS或无血清的培养基洗，避免细胞悬液残留蛋白质（血清）。台盼蓝对蛋白质有很强的亲和力，因此用不含血清的培养基洗涤和稀释细胞可使细胞活力的检测更为准确。 [2] 检测细胞活力时，为了检测精确起见，着色的死细胞及不着色的活细胞总数应计200个以上。
[3] 计数细胞的密度大约5×105个/ml，相当1个大格50个细胞。如果1个大方格超过50和小于10个细胞应该重新稀释细胞，以保证细胞在20～50个/大方格。
[4] 吸取含台盼蓝的细胞悬液后应立即滴加，避免由于细胞下沉而使计数不准。滴加细胞悬液的量应适当，过多或过少均会影响计数结果
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