两步法PCR扩增标准程序： Segment 1：预变性 95℃ 30秒 1 Cycle Segment 2：PCR反应 95℃ 5秒 60℃ 20秒 40 Cycles
Segment 3：Dissociation Curve
③ 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
●实验条件的选择
如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和PCR反应条件的研讨。实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，并可以在较大浓度范围内进行很好的定量。 ○反应特异性高的实验体系应具备以下条件：
No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。 不产生目的片段以外的扩增。
○扩增效率高的实验体系应具备以下条件： 扩增产物起峰更早（Ct值小）。 PCR扩增效率高（接近理论值100％）。 1. Primer浓度与反应性能间的关系如下：
降低Primer浓度有助于提高特异性；提高Primer浓度有助于提高扩增效率。图示如下：
2. PCR条件与反应性能间的关系如下：
① 要提高反应特异性，可以提高退火温度或变为2 Step PCR反应。 反应。
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