两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性 Hold
95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应 Repeat：45 times 95℃ 5秒 60℃ 20秒
Stage 3：Melt Curve
③ 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
◆应用Mx3000PTM Real Time PCR扩增仪的操作方法
请按照Stratagene公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。
① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不
同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。 *3 孔间误差校正请使用ROX Reference Dye II（50×）。试剂盒中附带的ROX Reference Dye
（50×）浓度高，不适合Mx3000P使用。 ② 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。
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