◆应用ABI PRISM® 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法
请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。
① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
调整引物浓度。
*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不
同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。 *3 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time
PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）
。与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50×）。
*4 96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal
Cycling plate采用20 μl反应体系。 ② 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。 < ABI PRISM® 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System >
两步法PCR扩增标准程序： Stage 1：预变性 Reps：1 95℃ 30秒
Stage 2：PCR反应 Reps：40 95℃ 5秒
60℃ 30～34秒*
-4-
Dissociation Stage
使用7000和7300时请设定在31秒。 使用7500时请设定在34秒。