③ 预变性。
预变性条件通常设定为95℃ 30 sec，使用此条件对于难变性的环状质粒DNA和基因组DNA模板也能够很好的变性。如果想改变变性条件，可以延长至1～2分钟。但是时间过长酶容易失活，不推荐使用2分钟以上的变性条件。 3. 各种试剂与反应性能间的关系如下：
TaKaRa公司有三种SYBR® Green Assay用的Real Time PCR试剂，这些试剂的反应特异性以及扩增效率间有以下关系。SYBR® Premix Ex Taq （TaKaRa Code: DRR041）是扩增效率高的试剂，但是，如果想提高反应特异性，使用SYBR® Premix Ex Taq II（TaKaRa Code: DRR081）或SYBR® Premix DimerEraser （TaKaRa Code: DRR091）则更有效。
●进行RT-PCR反应时的实验方法
进行RT-PCR反应时，使用SYBR® PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR063A）更为方便。SYBR® PrimeScript RT-PCR Kit由二部分组成，即：PrimeScript RT reagents （Perfect Real Time）Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR037A）和SYBR® Premix Ex TaqTM（TaKaRa Code：DRR041A，即本制品）。
这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：DRR063A），也可以单独购买。
1． 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。
*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。
使用单引物进行反转录时，使用量分别如下： Random 6 mers（100 μM） 0.5 μl（50 pmol） Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol） Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）
*2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。 2． 反转录反应条件如下：
37℃ 15 min（反转录反应）*3 85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）
*3 使用Gene Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃ 15 min。PCR反应有 非特异扩增时，将温度升至50℃会有所改善。
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