二代测序RRBS
建到pUC19当中，成为双载体系统。
a．PCR扩增sgRNA表达结构。
PCR体系如下：
U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC
U6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAA CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA c NNNNNNNNN NNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG(N即与target site反向互补配对的片段)
其中聚合酶也可以使用pfu或者Kapa Hifi代替，高保真聚合酶即可，U6模版推荐使用pSpCas9(BB)。
PCR反应条件如下：
该程序固定，不推荐更改。
PCR结束后，2%琼脂糖凝胶电泳验证，5ul PCR产物，15 V cm–1，30分。条带位置为370bp。
PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化，依照试剂盒说明，最终取35ul EB buffer，或者水进行回收。。