二代测序RRBS
b. 构建sgRNA载体—单载体系统（pSpCas9(BB)-2A-GFP）。
首先，按照前述方法target site确定，根据target site设计需插入的sgRNA Oligo。
一般来说，sgRNA oligo的形式如下：
sgRNA top: CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
sgRNA bottom: AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc
两条设计好的oligo需经磷酸化，退火成双链，其体系如下：
程序如下：37 °C 30 min; 95 °C 5 min; 每分钟降5 °C 至25 °C。
结束后按照1：200加水稀释（1ul oligo+199 H2O）
其次，将合成好的sgRNA oligo插入到目的载体中，本实验将使用pSpCas9(BB)-2A-GFP。其连接反应体系如下：