二代测序RRBS
c．sgRNA双载体表达系统（构建到pUC19中）
若利用pUC19建立双载体表达系统，首先依旧是参照之前的方法，寻找target site，设计引物用于扩增U6+sgRNA scafford；Fwd引物需含E coRI，Rev引物需含HindIII 酶切位点。之后进行酶切连接等操作。
酶切体系如下：
U6+sgRNA PCR产物酶切pUC19质粒酶切
酶切产物纯化，使用QIAQuick PCR purification kit，纯化后可-20 °C保存。
连接：酶切后的质粒与PCR产物按照1：3，室温连接15min。
连接反应结束后，推荐用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基。（可选做）
后续转化大肠杆菌，热击转化，涂板，挑单菌落，摇菌，提质粒，测序检测