浙江省部分地区儿童铅污染状况的
毒理学调查
指导老师：章荣华 合作老师：孟真、蔡德雷 （温州医学院仁济学院，温州，浙江325035）
摘要：目的 研究浙江省部分地区儿童铅暴露情况。方法 浙江省5个地区学龄儿童作为研究对象。采集儿童外周静脉血和晨尿，对血铅、δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶基因（ALAD）多态性和尿δ-氨基-γ-酮戊酸(ALA)水平进行分析。结果 500名学龄儿童中ALAD1-1基因型有476例（95.2%），ALAD1-2基因型24例（4.8%）,未发现ALAD2-2基因型。等位基因ALAD-1和ALAD-2的频率分别为97.6%和2.4%.淳安和桐乡儿童血铅水平（分别为78.217±2.95μg/L,146.994±1.55 μg/L）显著高于开化（53.555±2.29 μg/L）；ALAD1-2基因型血铅水平与ALAD1-1基因型血铅水平无显著性差异。路桥儿童尿中δ- ALA水平显著高于开化，桐乡儿童尿δ- ALA显著低于开化，其它地区没有明显差异。结论 浙江省部分地区可能存在较高的铅污染，铅对学龄儿童的健康影响值得引起重视。尽管本研究中ALAD1-2基因型并未表现高血铅水平，但作为敏感人群仍需要有关部门进一步做好监测和健康教育宣传。
关键词：血铅暴露；血铅水平；ALAD基因多态性；尿δ-ALA
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The toxicology survey about lead pollution in
Children from part areas of ZheJiang
province
Director: ZHANG Rong-hua Associate Director : MENG Zheng CAI De-lei （Renji College ,Wenzhou Medical College, Wenzhou, China, 325035）
Abstract： Objective To study lead exposure levels in children from part areas of ZheJiang province. Methods School-age children from part areas of Zhejiang province were chosen. Peripheral venous blood and morning urine of children were collected. Blood lead, polymorphism of δ-amino–γ- ketone e acid dehydration enzyme gene (ALAD) and urine δ-amino acid -γ-ketone (ALA) levels were analyzed. Results There were 24 cases of ALAD1-2 genotype (4.8%) in 500 school-age children，and 476 cases were ALAD1-1 genotypes (95.2%), while ALAD2-2 genotype was not found. The frequency of allele ALAD-1 and ALAD-2 are 97.6% and 2.4%, respectively. Blood lead levels in the children from ChunAn and TongXiang（78.217±2.95μg/L,146.994±1.55μg/L, respectively）significantly higher than those of KaiHua （53.555±2.29μg/L）. No significant differences were observed in blood lead levels between ALAD1-2 and ALAD1-1 genotype. δ-ALA levels in urine from LuQiao was significantly higher than those of KaiHua, however, those of TongXiang were significantly lower than those of KaiHua, and no obvious differences were found among the other areas. Conclusion High lead pollution of part areas in ZheJiang province may occur. It should been pay more attention to the health of school-age children exposed lead pollution. Although ALAD1-2 genotypes with high blood lead levels were not shown in this study, further monitoring and health education should be taken because of children is sensitive population with lead pollution.
Key words: Lead exposure; Blood lead levels; ALAD gene polymorphism ; Urine δ– ALA
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引言
铅是一种具有神经性的重金属元素，对儿童的生长发育，智力发育等有不可逆的危害性。随着现代工业和交通业的高速发展，环境污染日趋严重，铅中毒已经成为危害儿童健康的主要因素之一[1]。δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶(ALAD)基因遗传多态性与铅毒性易感性的关系是近年来研究的焦点。ALAD基因多态性在改变铅在体内代谢动力学作用方面起重要作用，从而影响其在血铅水平及毒理作用。国内已有关于学龄儿童的家庭情况，居住情况，生活习惯，健康状况及父母所处的职业等因素对血铅暴露影响的研究[2]，发现居住于低楼层；有不良的生活习惯，父母长期从事铅相关职业的儿童铅中毒率较高。关于儿童铅暴露、基因多态性和相关效应在国内也有相关的研究[3,4,5]，但在浙江省尚未见报道。为了了解浙江省儿童血铅暴露情况，本研究从毒理学角度对浙江省部分地区儿童ALAD基因多态性、血铅暴露水平和效应生物标志物尿δ-ALA进行分析，对这些地区儿童的铅暴露与基因易感性以及毒性效应的相关性进行初步的探讨。 一、研究对象
监测点:浙江省5个地区，具体为：杭州淳安县、衢州开化县、嘉兴桐乡市、金华兰溪市、台州路桥区。由于开化地处山区，工农业业污染比较少，因此在本研究中作为对照点。路桥地区电子垃圾处理工业发达，桐乡皮革业发达，金华兰溪化工医药业发达，淳安造酒业及旅游业发达。
研究对象：4-6年级在校学生。收集外周静脉血样，抗凝血0.6-1mL和晨尿(中段尿)15mL。 二、材料与方法 1 材料与仪器 1.1材料
DNA提取试剂盒 QIAGEN公司(批号：51104)
DNA扩增试剂盒 Takara生物工程（大连）有限公司（批号：DR001A） DNA酶切试剂盒 Takara生物工程（大连）有限公司 （批号：D1150A） 琼脂粉 BIO BASIC INC公司（批号：AB0013） 乙酰乙酸乙酯 分析纯， KEYGEN凯基生物公司 对二甲氨基苯甲醛 Sigma Aldrich
95％乙醇 杭州长征化学试剂化工厂 1.2主要仪器
Eppendorf centrifuge 5810离心机 德国Eppendorf份公司
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XW-80A涡旋混匀器 上海医科大学仪器厂 WFH-101B紫外凝胶成像仪 上海精科仪器有限公司 PTC-200PCR仪 美国生物科技有限公司 7K微型离心机 中国制造
DK-600S 37℃水浴箱 上海精宏实验设备有限公司 BIO-RAD电泳槽 美国生物科技有限公司 722型分光光度计 上海横平科学仪器有限公司 2 方法
2.1儿童血铅暴露水平
血铅的测定 本次研究选择开化、桐乡、淳安三个地区的血液标本进行血铅水平检测，方法参考《血铅临床检验技术规范》中的石墨炉院子吸收光谱法（GFAAS）。 2.2基因多态性
2.2.1 儿童人体外周血DNA提取
⑴.人外周血2-3mL，EDTA-K2抗凝。小心颠倒混匀，取出0.2mL，置于1.5mLEP管中。⑵.加入20μL/tube QIAGEN Protease（临用前按kit说明配制，溶于1.2mlsocrent），盖上cap，上下颠倒混匀2次。⑶.加入200μL，AL，vortex 15seconds。⑷.56℃ 10min。⑸.加入200μL/tube 无水乙醇，vortex 15seconds。⑹.快速离心，将EP管中的液体小心转移到mini spin column中，6000g，2min。⑺.弃去套管中的液体，并换上清洁的套管。⑻.加入500μL /tube BUFFER AW1.，6000g，2min。⑼.弃去套管中的液体，并换上清洁的套管。⑽.加入500μL /tube BUFFER AW2，20000g，2min。⑾.弃去套管中的液体，并将mini spin column置回其中。⑿.20000g，2min，以便彻底清除column中的液体。⒀.将mini spin column置于清洁的EP管中，室温静置5min。⒁.加入200μL /tube BUFFER AE，6000g，2min。⒂.收集EP管，做好标记后，-80℃保存。
2.2.2 基因组DNA扩增
采用PCR-RFLP技术对提取的DNA进行扩增。扩增引物：上游：5’-AGACAGACATTAGCTCAGTA -3’下游：5’-GGCAAAGACCACGTCCATTC-3’，PCR 扩增目的基因片段长度为318bp。 (1)PCR 反应体系见表1.
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表1 PCR 反应体系
成 分 体 积
10×Buffer缓冲液 3μL dNTP 10mM each 2.4μL Primer1 10uM 1μL Primer2 10uM 1μL Taq酶(5U/μL) 0.25μL 模板 1μL ddH2O 21.35μL
设立空白对照：不加DNA溶液，其它同上。将上述反应体系混匀，并离心数秒后开始PCR扩增。 （2）扩增条件
PCR循环参数：预变性94℃10min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，36个循环，终末延伸72℃10min，低温保持4℃。扩增结束后，取5μL扩增产物加1μL10×上样缓冲液，混匀后，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳40min（115V恒压），同时将Marker（DNA分子量标准）5μL电泳，当条带迁移至第3道和第4道中间时，停止电泳，在紫外灯下观察结果。
2.2.3 PCR产物酶切
按内切酶的说明书对PCR扩增的ALAD基因片段(318bp)进行酶切。酶切体系为20μL，具体见表2
表2 MspI 酶切反应体系 成 分 体积 10×Buffer缓冲液 2μL PCR产物 12μL 0.1%BSA 2μL ddH2O 3μL 内切酶 1μL
将上述体系混匀，并离心数秒后， 37℃水浴保温过夜。次日，取8μL酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，以确定ALAD基因型。
2.2.4基因型及等位基因比例计算
基因型（%）=该地区某种ALAD基因型例数/该地区总的例数。
等位基因概率计算根据Hardy-Weinberg平衡（p+q）2=p2+2pq+q2=1推算式中：p、q分别代表等位基因ALAD-1和ALAD-2。 2.3尿δ-ALA
2.3.1 标准曲线的绘制及样品测定
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