2.3.2 标准曲线的绘制
表3为标准曲线绘制体系
管号 0 1 2 3 4 5 标准应用液，mL 0 0.10 0.30 0.50 0.07 1.00 水，mL 2.00 1.90 1.70 1.50 1.30 1.00 δ-ALA含量，μg 0 1.00 3.00 5.00 7.00 10.0
取6支具塞比色管按表1配置标准管向各管中加入2.0mL缓冲液、0.40mL乙酰乙酸乙酯，混匀。于沸水浴中加热12min，取出冷却至室温。各加入4mL乙酸乙酯，加塞振摇100次，离心分层。分别取出2.0mL乙酸乙酯层于另外6支具塞比色管中，各加入2.0mL显色剂混匀，静置10min。在554nm处，用10ram比色杯，以零管为参比，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，δ-ALA的含量为横坐标绘制标准曲线。
2.3.3 样品测定
对每一尿样均取2支具塞比色管，在管中各加入1.0mL尿样、1.0mL水和2.0mL缓冲液混匀。其中一支为样品管，另一支为空白管。向样品管中加入0.40mL乙酰乙酸乙酯，空白管中加入0.40mL缓冲液，充分混匀。其他操作同标准管。
2.3.4计算X=mk /v
式中：X：尿中δ-ALA的校正浓度，mg /L；
m：由标准曲线查出的δ-ALA 的含量，g； k：尿样换算成标准比重下的浓度校正系数； v：分析时所取尿样的体积，mL。
3.统计方法
采用excel软件录入建立数据库，应用SPSS11.0统计软件包对数据进行方差分析和秩和检验。 三、结果 1.儿童血铅水平
本研究对开化、淳安和桐乡地区的儿童血铅水平进行了检测。由于血铅水平呈偏态分布，因此在本研究中采用几何分布进行统计和分析。结果见表4。 开化144例，血铅水平为3.7~504.55μg/L，几何均值为53.555±2.29μg/L；淳安117例，血铅水平为15.3~558.4μg/L，几何均值为78.217±2.95μg/L；桐乡131例，血铅水平为35.97~295.15μg/L，几何均值为146.994±1.55μg/L。淳安和桐乡儿童血铅水平显著高于开化（q检验，P＜0.01），桐乡儿童的血铅水平最高。
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采样点名称 开化K 淳安A 桐乡T F值 P值
表4不同地区儿童血铅水平 n 血铅的几何平均值(μg/L) 对应log10值（μg/L） 144 53.555±2.29 1.729±0.36 117 78.217±2.95 1.893±0.47**
131 146.994±1.55 2.167±0.19**
53.738
0.000 注：以开化为对照组，与淳安比，**P＜0.01；与桐乡比**P＜0.01
2.儿童血样标本提取的基因组DNA扩增和酶切的电泳结果
ALAD基因扩增和酶切结果是依据电泳后DNA片段大小进行判断。如图1（左）,当出现318bp条带时，即可判断目的片段被扩增出来，再对其进行酶切。如图1（右），当结果出现第1-5泳道所示时即为ALAD1-1基因型，出现第6泳道所示即为ALAD1-2基因型。
318bp
3.儿童基因型分布
318bp 232bp
图1 扩增ALAD片段（左）与MspI 酶切结果（右）电泳图 M：100bp ladder marker
注：3501、03、05、07、09、11为样品泳道，blank为对照组泳道。
各监测点学龄儿童ALAD基因的多态性检测结果显示（见表5），500名儿童中ALAD1-1基因型有476例（95.2%） ，ALAD1-2基因型24例（4.8%）。其中淳安7例，兰溪和开化各3例，桐乡9例，路桥2例，未发现ALAD2-2基因型。各个地区ALAD基因型分布构成比例未见显著性差异（卡方分析，P>0.05）。
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表5各监测点位学龄儿童ALAD基因的多态性检测结果
监测点 开化 淳安 兰溪 路桥 桐乡 合计
n 100 100 100 100 100 500
ALAD1-1 97 93 97 98 91 476
ALAD1-2 3 7 3 2 9 24
ALAD2-2 0 0 0 0 0
4.基因多态性对儿童血铅水平的影响 4.1不同基因型的儿童血铅水平比较
为了解血铅水平与基因型的关系，本研究对开化、淳安、桐乡三地区儿童的样本检测结果进行了分析（见表6）。三地共279例标本，其中ALAD1-2基因型19例，ALAD1-1基因型260例，ALAD1-2基因型血铅平均水平略高于ALAD1-1基因型，但两者比较，统计学差异无显著性（方差分析，P>0.05）。
基因型 ALAD1-1 ALAD1-2 F值 P值
表6不同基因型的儿童血铅水平 n 血铅几何平均值（μg/ L） 对应log10值（μg/ L） 260 88.838±2.51 1.948±0.40 19 94.929±2.51 1.977±0.40
0.090
0.764
4.2同一地区基因多态性与血铅水平关系
为了解同一地区血铅水平与基因型的关系，本研究对开化、淳安、桐乡三地区儿童的样本检测结果进行了分析（见表7）。开化ALAD1-1基因型儿童血铅水平（几何均数），与ALAD1-2基因型的血铅水平无显著性差异。淳安和桐乡的不同基因型间儿童血铅水平差异也无显著性（P＞0.05）
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采样点名 N1 开化K 97 淳安A 93 桐乡T 91
N2 3 7 9
表7同一地区不同基因型的儿童血铅水平
ALAD1-1（μg/ L） ALAD1-2（μg/ L） F值 p值 57.770±2.40（1.762±0.38） 26.503±4.37（1.423±0.06） 0.000 0.992
84.664±3.02（1.928±0.48） 84.275±3.02（1.926±0.48） 2.366 0.128 147.333±1.48（2.168±0.17） 159.294±1.35（2.20±0.13） 0.332 0.566
注：N1为ALAD1-1基因型的例数，N2为ALAD1-2基因型的例数，表格括号内为对应的log10
值。
5.尿δ- ALA检测的效应指标
晨尿δ-氨基-γ-酮戊酸(ALA)检测结果（见表8）显示，路桥地区学龄儿童尿δ- ALA（μg/mL）水平显著高于开化（q检验，P＜0.05），而桐乡学龄儿童尿δ- ALA（μg/mL）显著低于开化（q检验，P＜0.05），其它地区学龄儿童尿δ- ALA（μg/mL）与开化比较差异均无显著性（q检验，P＞0.05）。
采样点名称 开化K
淳安A 兰溪C 路桥Z 桐乡T F值 P
注：“*”，表示P <0.05
表8各监测点位学龄儿童晨尿δ- ALA检测结果
n 尿δ- ALA（μg/mL） 100 2.872±1.519 100 3.194±1.291 100 2.984±1.218 100 3.635±1.380* 100 2.628±1.100*
8.415 0.000
四、讨论
铅是具有多脏器毒性的重金属元素，它在人体的理想水平为零，对儿童的主要损害是影响大脑发育[6]。儿童期的神经系统正处于快速生长和成熟时期，对铅的毒性尤其敏感。长期暴露在铅环境中对智能发育产生的损害将不可逆转翻。因此准确检测儿童体内血铅含量。正确指导铅中毒儿童驱铅，对儿童的生长发育具有重要的意义。
血铅是反映近期铅接触的敏感指标，且其水平与铅中毒的程度密切相关。研究发现淳安和桐乡儿童血铅水平显著高于开化，其中桐乡儿童的血铅水平最高。国际儿童血铅中毒分级标准为：Ⅰ级，血铅＜100ug/L，相对安全；Ⅱ级，血铅100ug/L-199ug/L，血红素代谢受影响，神经传导速度下降；Ⅲ级，血铅200 ug/L-499ug/L，铁锌钙代谢受影响，出现缺钙、缺锌、血红蛋白合成障碍，可有免疫力低下、学习困难、注意力不集中、智商水平下降或体格生长迟缓等症状；Ⅳ级，血铅500 ug/L-699ug/L，可出现性格多变、易激怒、多动症、攻击性行为、运动失
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调、视力和听力下降、不明原因腹痛、贫血和心律失常等中毒症状；Ⅴ级，血铅≥700ug/L，可导致肾功能损害、铅性脑病（头痛、惊厥、昏迷等）甚至死亡。本研究对象中，开化和淳安血铅水平处于Ⅰ级，相对安全，而桐乡的血铅水平已经到达Ⅱ级范围，在此暴露水平下可影响神经传导速度和认知能力，使儿童易出现头晕、烦躁、注意力涣散、多动，这需我们引起重视。
研究发现ALAD1-2型个体在铅暴露时更容易发生高血铅，是铅毒性的易感和高危人群[7,8] 。本研究结果发现ALAD1-2基因型血铅水平与ALAD1-1基因型血铅水平无显著性差异。但有趣的是，对照地区的ALAD1-2基因型血铅水平反而降低。与之前报道的ALAD1-2基因型血铅水平不符[3]。可能与本研究的样本量较少，检测到的ALAD1-2基因型数量较少有关。另外，开化地处山区，绿化覆盖面较大，工农业污染较少，空气质量较好，因而铅暴露水平本底值较低，ALAD1-2基因型血铅水平低也可能是一种自然的现象。
人体内的铅全部来自外界环境，外界环境包括大气污染、家居环境中的铅均会引起儿童铅中毒，并主要由消化道和呼吸道进入儿童体内[9]。对不同监测点ALAD1-2基因型血铅水平进行数据统计分析发现，桐乡和淳安地区的儿童血铅水平显著高于开化地区。分析原因之一可能是所处环境的差异。经过对淳安，开化，桐乡三个地区的工业情况调查发现，桐乡以皮革业为主，产生大量的废水，重金属污染比较严重；开化所处地理较偏僻，绿化较多，工业污染很少，反映的是一种比较原始的状态；淳安地区的工业主要为造酒业，近年来旅游经济发展迅速，由此带来一系列副反应令人担忧，比如水源水污染、汽车尾气污染等。因此本研究铅暴露水平的结果与各个地区实际污染情况是比较吻合的。
Wetmur等研究发现，ALAD基因第4外显子的第177碱基发生G-C突变，这个突变改变了ALAD酶构象，增加了AIAD2亚单位与铅的亲和力，使AIAD2亚单位与铅的结合更为紧密，从而导致携有AIAD2亚单位的个体(ALAD22 型和ALAD12 型)在受到铅暴露时更容易发生高血铅和铅中毒[10]。本研究采用PCR-RFLP技术对ALAD基因型进行检测，理论上可得到三种基因型：ALAD1-1基因型、 ALAD1-2基因型、 ALAD2-2基因型。结果中只检测到ALAD1-1和ALAD1-2两种基因型，未发现ALAD2-2基因型，这与已有的国内报道相似[11]。根据Hardy-Weinberg平衡（p+q）2=p2+2pq+q2=1推算出2种基因型的理论分布频率为：等位基因ALAD-1和ALAD-2的频率分别为97.6%和2.4%，这与先前报道的上海职业接触工人的基因型分布频率（等位基因ALAD-1和ALAD-2的频率分别为97.05%和2.95%）相似[12]。ALAD基因型分布各地区之间无显著性差异。提示浙江省儿童对铅毒性的易感程度可能是相似的。
在铅中毒机制中，铅会抑制ALAD和血红素合成酶的活性。ALAD受抑制后，
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