表1。
3.3 分析方法
3.3.1 铅，铜和锌的总含量
在与硝酸消化后，通过石墨炉原子吸收光谱（PE）测定C fluminea中总金属含量。分析精确度和准确度通常用牡蛎组织标准物质作定期检查（SRM 1566b–NIST)。过滤水样中的金属总浓度经氨盐基吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(APDC)和甲基异丁基酮的液提取后，进行石墨炉原子吸收光谱法测定。这个做法为了预浓缩金属，特别是铅，从而降低检测下限。经认证的标准淡水参考物（从NIST的SRM1643d）用于核查在水样中的金属测定的准确性。偏离认证值5%内的被认为是允许的。空白样品中的含量比较与样品中金属含量是可忽略不计的。 3.3.2 ALAD活性
ALAD活性测定方法是从血液中ALAD在活性测定欧洲标准方法改良而来（Berlinand Schaller, 1974）。简而言之， C fluminea的整个软组织用0.1M磷酸缓冲液（PH=6.6）匀浆。该组织匀浆经4℃，10，000rpm离心15分钟后，取上清液，分成五份，每份50μL。再将200μL磷酸缓冲液加入其中的两份中，再将200μL的ALA-试剂（含δ-氨基酮戊酸）加入到剩下的几份。该混合物室温孵育2小时后，加入750μL沉淀试剂（含有三氯醋酸），混合30分钟。然后在2500rpm离心5分钟。将离心后的上清液取500μL转移到一个塑料管中（1mL），再与500μL的埃尔利希显色剂混合，在25℃下作用15分钟。在550nm下测定淡水双壳类的PBG和空白对照组的紫外分光光度值。对ALAD的活性表示为ngPBG/ng总蛋白。
3.3.3 LPO浓度
过氧化脂的确定使用总蛋白的定量用的上清液。根据 Erdelmeier 等人的方法来测定在膜上脂蛋白不饱和脂肪酸的过氧化的分解产物丙二醛（MDA）和4-hydroxyalkenals（4-HNK）。C fluminea中的过氧化脂的浓度表示为μL /g蛋白总量。 3.3.4 总蛋白含量
采用ALAD定量中的上清液测定样品中总蛋白的含量，根据Lowry法（1951）用BSA（牛血清蛋白）作为标准物质，并表示为mg/g湿重. 3.3.5 铅同位素
一共有9个生物样本用于同位素分析，主要使用传统的硝酸消解和标准的阴离子交换柱分离方法。将每一批经冻干的且曝气后的生物标本匀浆，并回收具有代表性的铅50-100ng进行分析。这9份样品分别对应5个夏天样品和4个冬天的样品。实验的空白管使用淋洗柱均优于0.1ng铅。因此，空白管被认为是收集极少量的双壳类。同位素是根据热力学海王星ICP-multi-collector质谱仪、报导了208Pb/204Pb，207Pb/ 204 Pb，206Pb/204Pb ，208 Pb / 206Pb比率。对于每个分析会议,多重分析国际标准的参考资料NBS981给下列值的不确定性,外部重现二倍标准差表示。会议 (n = 12):206Pb / 204Pb 16.9405±0.0007;207Pb / 204Pb 15.4973±0.0009;衰变/ 204 /铅36.716±0.004)。会议(15例):206Pb / 204Pb 16.9405±0.0010;207Pb / 204Pb 15.4973±0.0010;衰变/ 204 /铅36.716±0.003)。更正的数据被作为内部标准(Ketterer et al,1991)。在讨论之后,参考了铅
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同位素分析瓜迪亚纳河较低的河水(图4)。这些分析指未过滤，酸化水样采集供同位素分析。从韦尔瓦 (西班牙)和阿维罗(葡萄牙)大学在2005年作为的UTPIA项目的一部分(见第1个以上)。所有铅的数据对这些样品是不完整的，未在这里被报道。 3.3.6 统计分析
金属的浓度（铅，铜，锌），以及ALAD活性和过氧化脂质浓度在C fluminea中表示为平均浓度±标准差（sd），中位数和范围。数据分析使用STAISTICA6.0软件包。数据的标化使用Kolmogorov Smirnov检验，数据齐性经由Bartlett's test检查。只有过氧化脂质的数据未能满足方差分析的假设，因此，对数变换后的数据是用ln（x+1）。回归分析也适用于铅和ALAD、过氧化脂质和ALAD平均浓度间关系，显著水平定为0.05。 4.结果
4.1 金属含量
夏季和冬季C. fluminea 中总铅量结果见表2. 点位1处，生物标本中的铅浓度在 (2.49±1.08ug g-1 d.w)，该处毗邻Mina de Sao Domingos废弃矿区，铅浓度高于主流域的6倍，主流域通常为0.2 ~0.5ug g-1 d.w. 点位4虽然远离点位1，但是结果显示两个季节采集的C. fluminea 中铅含量较高（N0.6ug g-1 d.w）。除了点位3，各点位水体中铅的水平较低，冬季水样普遍低于0.1ug g-1 d.w的检测限（表1）。冬季，由于Guadiana River水量的增加，体现了人为活动产生的铅经自然稀释的净影响。河流各点的铜浓度保持不变，仅在夏季稍高，但没有统计上的差异（表1）。同样地，各采样点C. fluminea中锌含量以及不同季节之间均没有差异（p＞0.05）（表1）。 4.2 ALAD和LPO的生物标志物
ALAD在C. fluminea组织中酶活性见表2。 一般来说, 在夏季采集的标本中ALAD活性更高，反映出ALAD作为生物标志物存在季节差异。虽然有季节差异，ALAD的空间分布趋势在两个季节是一致的，与组织中的铅浓度呈负相关。因此，在点位3和点位5，生物样品中的ALAD活性显著升高（1.18±0.28和1.72±0.005ngPBGmin-1mg-1总蛋白），而铅水平最低（见表2）。对应于组织中铅的最大浓度，在点位1和4处采集C. fluminea标本的ALAD活性较低（pb0.05） (见表2)。夏季采集的C. fluminea中脂质过氧化活性明显较高，这与ALAD活性在夏季较高一致（见表2）。点位5的过氧化脂质的浓度较高，为610.5.±15.8 and 545.2±29.0 μmol MDA+4-HNE g? 1总蛋白，其次是点位1和点位4，分别是531.1±15.8 和545.2±29.0 μmol MDA+4-HNE g? 1 总蛋白。
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4.3铅和生物标志物之间的关系
铅浓度与ALAD活性的关系反应在图2。我们计算了ALAD和铅之间的负相关指数，夏季：(ALAD = 1.78e?1.79[铅]在，冬季：ALAD = 2.09e?6.62[铅]（图2)。此外，也计算了C. fluminea中脂质过氧化物的浓度与ALAD的负相关关系，夏季：LPO含量=?225[ALAD]+ 650)；冬季：LPO含量=?314[ALAD]+ 349（图3）。 虽然没有统计学差异,但是在C. fluminea体内，LPO的增加与同铅浓度的增加是一致的。这种关系,如果被证实，在生态毒理学中是非常重要的，值得作进一步研究。 4.4铅同位素
C. fluminea中铅同位素的结果列于表3和图4。lower guadiana河水样和海洋贝壳类数据报道也列于表3。图4包括了来自lower guadiana 河地区的地理条件、基于土壤的人为活动所产生的铅的分析（未公布的数据，UTPIA项目）。这个信息被挑出来是为
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了加强对淡水双壳类数据的解释。C. fluminea中铅同位素的结果显示了同位素组成具有明显的季节性变化趋势，在雨水较充足的冬季， 207pb/204pb比值往往较雨水较少的夏季更高。这些变化远远超过系统误差（内部和外部），说明了铅的来源具有明显的季节性差异。在矿化范围内，双壳类中同位素成分的减少，可以解释为高水平人为活动产生的铅暴露主要来自于废弃的矿。低于矿化范围，则定义为混合线，既有矿相关的铅来源，也有研究区域内上游Guadiana 河来源的铅。这种混合的方式，被点位3 和潮汐河口之间的水样的检测进一步证明。点位2在干旱季节的同位素组成有些特殊。C.fluminea暴露的铅是典型的铅汽油的同位素组成（如1999年以前）。在讨论中，将有更详细的说明。 5.讨论
5.1生物标志物和铅
C. fluminea被选为研究对象，是因为它能满足一个良好的生物指标的许多要求(Phillips, 1980)。;它是不迁移的，分布广泛、寿命长、有大量的组织块可用于分析。这个物种乐于积累重金属和身体的负担，似乎反映着随时间变化的平均暴露水平 (Marie et al, 2006)。因此，C. fluminea已经被广泛用作水体的生物监测器用以评估金属污染，也作为一种衡量金属蓄积和淡水系统有机体金属 毒作用机制的物种(Marie et al, 2006; Champeau et al, 2007)。C. fluminea 中的铅水平(upto3.73μgg?1 d.w)，虽然也反映出污染的影响，但较自美国Spring River 盆地铅矿区采集的双壳类，铅浓度为1.0-23ug g-1 Pb d.w相比，仍不是特别高(Angelo et al, 2007)。相反，在巴西从一个有采矿废弃污染的河流采集来的C. fluminea中的铅浓度只有2.41ug.g-1dw(Guimaraes, 2007)。此外，在lower Guadiana河地区，C. fluminea中的铜和锌的含量在不同河流位置和季节没有显著差异。这与Angelo et al, 2007报道的结果不同。Angelo的结果显示，在the Spring River Basin各采样点采集的C. fluminea中的金属浓度有波动，这与河水的流动条件，与地表水的交换以及沉积物化学等有关联。在本研究中，铜、锌水平低。由于这些元素是自然环境中天然存在的必需元素，C. fluminea可以调节它们，至少在可检测的范围内。如果铜和锌含量持续较高高，C. fluminea的金属调节能力可能下降。尽管没有证明，但是相当长时间的净化可能已经在一定程度上降低了的金属浓度(Angelo et al., 2007)。正如Schmitt et al. (2007)注意到的，公布的ALAD活性的结果是很难进行比较地，由于不同的方法和不同的表示单位。类群之间的比较甚至更加复杂，因为在脊椎动物中有血红蛋白，而在C. fluminea中缺乏血红蛋白。无论如何，当铅存在时，ALAD的活性受到抑制在其它的生物体，如鱼(Schmitt et al, 2002)、大鼠(Tahara et al, 2007)和人(Ahamed et al, 2006)中都有报道。关于双壳类中ALAD活性的报道只有1篇(Kalman et al, 2008)。在本研究中，沿Huelva(Spain)海岸的海洋Chamelea gallina也被收集用于分析ALAD活性和铅水平。作者同样发现了ALAD活性与铅含量在Chamelea gallina中存在明显的负相关关系，确认ALAD活性的与铅浓度的增加有关。最令人惊奇的是在C. fluminea中ALAD活性有着显著的季节性差异。由于双壳类的生长繁殖的周期可能导致动物代谢的季节性变化，这可能影响到生化指标。因此,C fluminea ALAD活性在夏季和冬季的差异可能是由于在动物的生理学变化。因此，季节性必须被看作是一个评估双壳贝类铅影响
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ALAD活性的重要的因素。
虽然不同季节铅的水平在不同点位没有统计学差异，除点位2外，但软组织中ALAD活性和铅浓度显著负相关(图2)。这与几乎所有的其他研究一致，并证实了铅的负面的生态毒理效应，如细菌(Ogunseitan et al,2000),鱼(Conner and Fowler, 1994;Schmitt et al., 2002; Costa et al, 2007)，两栖类 (Arrieta et al, 2000)，爬行类(Overmann and Krajicek, 1995)，鸟类(Strom et al, 2002; Martinez-Lopez et al, 2004; McBride et al,2002)， 哺乳类(Tahara et al, 2007) 和人 (Tandonet al, 2001; Gurer-Orhan et al, 2004; Ahamed et al, 2006)。
尽管尚未完全明确，但铅能通过增加细胞内的活性氧自由基，如羟基自由基， 超氧化自由基和hydrogen peroxide等的含量导致脂质过氧化能力的增加(Gurer and Ercal, 2000; Pande and Flora, 2002)。一个可能的机制是5-氨基酮戊酸（ALA）的积累，可能迅速被氧化生成活性氧(Hermes-Lima et al,1991; Costa et al, 1997)。过氧化物脂质水平，也可能由于如铜或锌等其他金属存在而增加。由于C. fluminea中没有出现铜和锌的浓度波动，可能这些金属的存在对于控制LPO起到了重要作用。夏季采集的C. fluminea中过氧化脂质与铅浓度有关联，脂质过氧化程度与ALAD活性有着密切的负相关(图3)。这表明，ALAD活性的抑制，除了作为一个铅毒性的一个生化指标外，也可能是铅引起机体的氧化应激的一个指标。就如Ahamed et al. (2006)等人推测的一样。LPO水平和ALAD活性的相似关系人类的研究中也有报道。它较好地反映了在人中由于高浓度铅暴露产生的氧化应激(Sugawara et al., 1991; Jium and Hsien, 1994)。 5.2铅同位素
图4证实了双壳类中富集的铅与人为活动密切相关，尤其是葡萄牙的Mina de Sao Domingos and 西班牙的Las Herrerias两个地点。这两地处于lower Guadiana河的集水范围，尽管他们的铅负荷在到达Guadiana前被大幅稀释了，但是它们的硫化矿石同位素信号被保存。从米娜迪圣多戈什排放到Rio Chanca ，它们的汇合处在Guadiana河以北18公里。同样，来自拉斯维加斯埃雷里亚斯的水经过Rio Chanca排放到Guadiana河。地球上8铅主要是由Devonian or Carboniferous rocks的天然天气带来，如果有，也是非常少量的。
图4反映的第二个最重要的特征是铅同位素组成的季节性变化。可能的解释是枯水期和丰水期水流和地表径流的差异。正如lower Guadiana河水位最低时为夏季（除了2005年干旱的夏季和2004年干燥的冬季），从废弃的采矿区的污染减少。
第一和第二顺序溪流几乎荒废，唯一的大流量是严格意义上的瓜迪亚纳河。因此，该瓜迪亚纳河（因而双壳类同位素组成）反映铅的正常来源，被大量的开矿相关的铅来源所隐蔽。在此基础上,阵B(图4)代表了一个铅来源的混合模式，从米娜迪圣多戈什和拉斯维加斯埃雷里亚斯的少量人为活动铅来源，以及在上游瓜迪亚纳河集水区的不明来源铅。因为瓜迪亚纳河水的数据是指未过滤的水样，测得的值悬浮微粒铅和铅溶解的综合。由于C.fluminea 是悬浮觅食的双壳类，双壳类和水之间的数据非常一致，可以充分上述假设。为了建立一个生物富集的模型，必须有一个生物动力学的方法。虽然上游集水区终点的同位素组成是推断的（是基于IPB北部铁矿石的同位素比例推测
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