3、NH4Cl预处理液。10X或1X的NH4Cl预处理液在4℃避光保存,可长期保存。在保证容器无菌时,1XNH4Cl可预先大量配制。
(十) 电脑与客户端软件设置
1、在检测过程中,电脑不能进入待机或者休眠。使用前,需将待机、睡眠、关闭显示器等设置修改为“从不”。 2、目前软件能够支持WindowXP、Win7、Win8操作系统。在安装时,需要由工程师安装相应的驱动软件,并进行通信端口的设置。因此不建议随意更换操作电脑。
3、在客户端软件的更新升级时,需要确认电脑通信端口与软件中的端口相一致。进入电脑“设备管理器”界面,打开“端口”下拉菜单,将“USB serial…(COM?)”中的串口设置为串口X(如COM3,且此端口不能被其他设备占用);在客户端软件中,将软件的端口也设置为X端口(如COM3)即可。
4、“管理员配置”密码为20060117。“MaxSt差值上限”与“MinSt差值下限”(在博奥设备客户端中,此二
项为“ΔSt上限”、“ΔSt下限”)的设定不需要密码。其他参数的修改需要以此密码获得权限。
二、 检测原理
在检测体系中,针对SNP突变位点的碱基,设计有两条配对碱基不同、荧光标记也不同的探针,能够分别识别一种突变。在纯合子样本中,当某条探针与模板完全匹配时,该探针的竞争能力最强,能够优先与模板结合并产生荧光信号,此时,该探针的St较小,信号增长快并信号值较高,而另一条探针则St较大,信号增长慢且信号值较低。
(St是按照特定的运算规则得到的一个反应循环数值。良好的荧光曲线一般为S型或接近S型,St一般在S型曲线下部的拐点位置,此时,两条探针间的竞争能力的差异表现的最明显。)
以CYP2C19*3的检测产品02CYP2C19*3为例。该产品的每管试剂内,都有FAM-G探针、HEX-A探针。FAM-G探针能优先与突变位点碱基为G模板的结合,并由通道1进行信号的检测,HEX-A探针能优先与突变位点碱基为A模板的结合,并由通道2进行信号的检测。如果样本为纯合的AA基因型,则HEX-A探针优先于模板结合并快速增长(绿色曲线),FAM-G探针与模板的结合能力弱,信号产生时间晚且信号增长慢(蓝色曲线),如图1。在纯合GG型样本中,情况与上面相反,如图2。在杂合AG型样本中,两条探针都能顺利的与目标模板结合并产生信号,其St值较接近,信号的增长也较一致。 三、 分型判读的依据
在对数据进行分型判读时,软件的运算逻辑是:①依据St值上限与St值下限确定有效循环数范围,范围之外的循环数值及信号不考虑;②依据通道一阶导阈值,排除信号过低的循环及其信号③依据MaxSt差值上限与MinSt差值下限,判定基因型,得出最终分型结果。
1、依据St的ΔSt的分型
分型主要的依据是St的差值。在参数的设定中,ΔSt是两个通道的St值的差值,即ΔSt=St通道1-St通道2。在普通的单个SNP检测中,由于FAM-探针、HEX-探针对模板结合能力的差异,使ΔSt存在正值、负值的差别,其正负差异及差值的大小是进行基因分型的主要依据。
以2位点(CYP2C19*3)的检测数据(哈医大二院演示实验数据)为例,其检测数据如下: AA型 Stchannel1=35.6609 Stchannel2= 27.0791 ΔSt=+8.6
(图1)
GG型 Stchannel1=31.4214 Stchannel2=37.4288 ΔSt=-6
(图2)
AG型 Stchannel1=29.4933 Stchannel2=28.4751 ΔSt=+1
(图3)
在产品的研发和出厂检测中,对产品的ΔSt的控制要求为:纯合质粒中ΔSt>4(上限),ΔSt<-4(下限),杂合质粒