S58条件下为5-50)作为有效的、可靠的St区域。在此循环内的数据,才会进行ΔSt、通道一阶导阈值等参数的比较。
St是受模板量影响的。模板浓度高,则检测时的St会减小;使用纯化的基因组时,检测得到的St也会较白细胞样本小,这种情况是正常的。一般说来,St值上限与St值下限是固定的参数设定,不需要进行修改。如果由于模板浓度高或纯化的样本导致St较小到小于20,可以通过“管理员配置”修改对应通道的“St值下限”。
五、影响实验效果的因素
1、如何判断一个数据是否是良好的结果
对于普通的SNP位点,我们在研发过程中会根据检测情况调整探针的设计和温控程序。依据目前的数据看,一个良好的检测结果,具有以下特征:
①曲线呈“S”型或者类“S”型。如图4、图5中的白细胞样本;
②在天隆设备中,通道1、通道2曲线能够达到或者接近达到平台期,信号强度一般在3000(通道1)或2000(通道2)以上;在博奥设备中,通道1、通道2曲线能够达到或者接近达到平台期,信号强度一般在3000(双
通道1);需要注意的是,质控的信号一般比检测的白细胞样本的信号高,但是其分型只能作为参考,而不能代表实际的白细胞的分型。白细胞的分型图谱一般比质粒好,其阴性曲线一般较低,杂合白细胞曲线更为重合。
③纯合子质粒的ΔSt差值在+4以上或-4以下,阴性曲线信号较低或者没有阴性曲线;杂合质粒ΔSt一般在+2至-2以内;
或者简单说来,曲线线型与跟随试剂发送的质检报告相类似,数据良好。 2、温度
需要说明的是,温度对探针的竞争能力有显著的影响,进而影响样本的ΔSt。当温度较标准温度高时,样本的ΔSt的绝对值会增大,样本分型效果更好。但是温度过高会使探针的信号降低,不利于数据的可靠性分析,造成样本重测。同时,如果温度过低,检测时样本的分型会变差,导致不同基因型之间曲线类似,不能分型。如下图所示60位点CYP2C19*17试剂高温、低温测试。
60位点CYP2C19*17高温试验(64度)(图4)
(质粒)
60位点CYP2C19*17低温试验(61度)(图5)
(白细胞)
(质粒)(白细胞)
由于设备间难免存在温度的差异,某些位点在进行检测时,其信号会相对较低。此时,需要将温度降低以保证信号强度,从而保证其数据的可靠性。对于不同的位点,对温度的敏感性也不同。以图4、图5数据为例,60位点CYP2C19*17对温度不敏感,并且在适当的高温时其分型更好。而1、68、93位点则较敏感。
反应温度修改方法:(以基因组-62为例)
进入软件温控选择界面。选择位点的程序,进入。
(天隆设备)
(博奥设备)
在“温控设置”(博奥设备客户端中为“程序设置”)内,将“过程3”的“步骤2”中的“62℃”修改为目的温度60度。
(天隆客户端修改前)
(天隆客户端修改后)
(博奥客户端修改前)
(博奥客户端修改后)
点击左侧界面中的“保存”,保存后“保存”按钮会变为灰白色。保存设置后,即可。