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设备的温控、软件等设置在进行技术演示时会由技术支持人员进行检查。若在正常检测时,发现某位点信号持续较低,请联系技术支持人员,由公司技术支持人员进行现场维护或者指导温控的调整。 3、模板量
保证足够的模板量才能保证实验的成功。样本量太少时,会使检测的信号过低,St也会延迟到40个循环之后。此时,样本往往有趋势明显的曲线,但信号低,数据不可信。
76位点样本过少 (反应完全完成) 1位点样本过少(反应没有完全完成)
在富集白细胞时,注意观察管底是否有白色的白细胞聚团。如果聚团明显,则表明富集较好。如果聚团不明显或者没有白色的白细胞聚团,则需要再次进行富集。在使用耀金保溶解时,可以根据检测的试剂需要添加耀金保。如果只进行少量位点的检测,可以减少耀金保量至20ul,以相对提高模板浓度,保证检测效果。 4、位点分组
我们依据反应温度对位点进行了分组。在相同分组内的位点,是可以在一次反应中同时检测的。如果将低温组调整到高温组进行检测,样本的分型会优化,但是信号会降低甚至不能检测出有效信号。高温组位点到低温条件下检测时,分型会变差,各基因型间ΔSt会减小,白细胞检测信号会上升,检出率会提高。我们建议使用分组所在的温度
进行检测,如果检测效果持续信号较低,可以降低温度,但降低的幅度最好不要超过1度。 5、富集白细胞时离心力的选择
在进行白细胞富集时,离心力一般是3000rpm。由于某些离心机的转速可能达不到要求,造成富集的白细胞较少。此时,可以将离心力提高到3200-3500rpm。但是不建议离心力高于4000rpm。离心力过高,会使白细胞团过于紧密,导致耀金保无法溶解细胞团。
对于一些大型离心机,离心力和离心时间需要根据实际状况进行调整。离心力过高会沉淀过多的红细胞碎片,导致样本颜色太重,影响设备对信号的检测。 6、循环数的要求
目前标准检测程序为55个循环,反应总时间一般在2.5小时以内。依据目前的经验,在50循环内既能完成检测。若样本信号已经达到分型的要求,可以在保存数据后提前终止反应,缩短反应时间。如果信号较低(在运行监控界面目测信号低于1000),建议完全完成检测反应,保证信号的可靠性。
提前终止反应时,需在运行界面点击“保存”按钮,以保存实验数据。 7、试剂的保存与使用
试剂需要在-20℃条件下避光保存。使用时依据需要取用试剂,避免反复冻融试剂。试剂为25ul标准体系,试剂在使用前,需要稍微离心,将粘附在管壁的试剂甩到管底,以保证体系的完整性;体系缺失太多时,检测信号会较低甚至检测失败。 8、适用的样本
人全血需要按照样本处理方法进行白细胞的纯化后才能用于检测;肌肉等组织样本等需要使用液氮冷冻研磨后使用;纯化的基因组样本可以直接检测; 9、野生型与突变型的说明
我们一般将“>”前面的碱基作为野生型,而后面的碱基作为突变型。而使用”>”区分野生型和突变型是没有特别固定的硬性规定的。一种说法中的野生型,换成另外的说法就是突变型。在严格的讨论中,是以碱基型,即AA
(TT)或GG(CC)或AG(CT)来说明的。我们的用药指导指南中,也是以基因型为准的,就是为了避免不同说法中对野生型和突变型的混淆。
如58位点 CYP3A5*3 (G>A) rs776746 在PharmacyGKB网站中的数据,如下。
五、典型位点分型图示(相同基因型中,分别是质控、白细胞样本检测图) 各位点的分型图谱请参阅试剂的出厂质检报告。 1位点CYP2C19*2分型图谱 天隆设备 博奥设备