生物工程工艺综合性实验报告
院 （系）： 城市建设学院 专业班级： 生物工程1101 学生姓名： 马 雪 文 学 号： 20111171041 指导教师： 李 世 杰
20 14 年 5 月 26 日至20 14 年 6 月 15 日
发酵工艺综合性实验指导书
一、 实验目的
微生物发酵技术是生物工程最核心的技术，微生物发酵按其对
氧的需求可分为好氧微生物发酵，和厌氧微生物发酵。好氧和厌氧发酵有较大的区别，各自对工艺条件、发酵设备有不同的要求。分别掌握好氧和厌氧发酵技术也就比较全面的掌握了工业微生物技术。
本实验分别开出典型的好氧和厌氧发酵实验，训练学生掌握这两种工艺的基本技术、操作程序、分析手段，全面锻炼同学们实际动手能力。巩固和提高微生物净化操作能力、显微观察技术、培养基配制和灭菌技术、无菌取样和细胞量的确定、生长曲线的制作、光谱分析技术、气象色谱分析技术。初步培养同学们工业微生物领域科学研究和技术开发的基本能力。 二、 实验原理
红曲霉通过有氧发酵将淀粉质原料转化为次级代谢产物红曲色素。 丙丁梭状芽孢杆菌经厌氧发酵将农副产品转化为丁醇和丙酮。 三、 实验内容
1、好氧实验：红曲的发酵实验及其抑菌作用研究 2、厌氧实验：丁醇的发酵实验及其气相色谱检测 四、 仪器设备和试剂、消耗品： 1．
仪器设备： 电子分析天平
手提式蒸汽灭菌锅、自动控制蒸汽灭菌锅 双孔水浴锅 1000W电炉 5台
生物显微镜、电脑成像生物显微镜 生物培养箱、培养摇床 真空干燥箱 紫外可见分光光度计 离心机
真空泵、真空干燥器
蒸发器 气象色谱仪 2．
药品和耗材：
药品：可溶淀粉 1瓶（500克），蛋白胨 1瓶（500克），琼脂，饴糖（麦芽汁）麦芽1000克，大米粉 5公斤，硝酸钠NaNO3 1瓶（500克），磷酸二氢钾KH2PO4 1瓶（500克），磷酸氢二钾K2HPO4 1瓶，硫酸镁MgSO4·7H2O 1瓶（500克） ,硫酸铵(NH4)2SO4 1瓶，氯化锰MnCL2 1瓶，硫酸锰MnSO4·H2O 1瓶，碳酸钙CaCO3 1瓶，维生素B1(盐酸硫胺素)1小瓶，酵母膏1瓶，乳酸（液态1瓶500克），葡萄糖（分析纯）1瓶，乙醇（分析纯）5瓶(5×500克)，乙醇(色谱纯Aladdin) 2瓶,丁醇（色谱纯Aladdin）2瓶，丙酮（色谱纯Aladdin）2瓶，叔戊醇（色谱纯Aladdin）2瓶
耗材：500ml三角瓶50只， 250ml三角瓶16个，100ml粗口径试管50只，1000ml烧杯10个，培养皿160套，常规试管160个，200ml烧杯16个，1ml移液枪头5盒，标签纸若干，玻璃真空干燥器大号1个，波美计8只，移液枪（1000ml）2只，玻璃珠2盒，100ml量筒8个，500ml量筒2个，称量纸2盒，不锈钢试剂勺4根， pH试纸2包，玻璃棒若干，玻璃推棒32根，5ml移液管16只 五、实验方法步骤和具体操作过程 （一） 红曲的发酵实验及其抑菌作用研究
红曲是一种具有一定营养和药理作用的纯天然红色素，可赋予肉制品、食品、饮料等鲜艳的色泽及特殊风味，而且具有较好的营养价值和一定的防腐作用，因而被广泛地应用于食品工业。
红曲是由红曲霉经发酵分泌到胞外的一种色素，发酵的主要原料是淀粉类如大米、薯类等。红曲霉发酵合成色素同时对有害菌产生抑制作用。本实验分为两个部分，前一部分为红曲的发酵实验，后一部分为红曲的抑菌试验。 （Ⅰ）红曲的发酵实验 1．菌种
本实验室保藏的红曲霉菌种monascus purpureus。用本实验室自主设计的保藏方法，在短梗霉多糖膜片中封存，置于冰箱中保藏。使用时每取出一片，进行活化，然后作为种子扩大培养。
2．培养基
①斜面试管和平板培养基：
饴糖培养基：6～8。Bx饴糖100 mL，可溶淀粉5 g，蛋白胨3 g，琼脂2 g，121℃灭菌30。每大组制备200ml用于制作平皿
用于菌种活化则不加琼脂，100ml饴糖培养基装入500ml三角瓶中（加入一定数量的玻璃珠）121℃灭菌30分钟备用
*饴糖（麦芽汁）的制备：大麦芽50克，粉碎后加入4倍于麦芽重量的水，搅拌均匀，在55℃至60℃的保温箱中糖化4小时，取出过滤得麦芽汁，测波美度，灭菌备用。
以上麦芽汁的制备分为四个大组进行实验，每大组做2瓶试样， ②种子培养基为：
大米粉3% ，硝酸钠O.5% ，KH2PO4 0.15% ， MgSO4 0.1% , 250ml三角瓶中装量100ml，pH6.0乳酸调（加入一定数量的玻璃珠），121℃灭菌30分钟备用（或可溶性淀粉3g，硝酸钠0.3g，黄豆饼粉0.5g，水100ml “微生物学实验” 胡开辉）每小组做一瓶 ③发酵培养基为：
a. 大米粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.2% ，pH6.0乳酸调 b. 小麦粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.2% ，pH6.0乳酸调 c. 玉米粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.2% ，pH6.0乳酸调 d. 木薯粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.2% ，pH6.0乳酸调 e. 土豆粉9% ，硝酸钠O.2% ，KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.2% ，pH6.0乳酸调 f. 称取100g籼米热水浸泡1小时，沥干，入玻杯中，灭菌锅中蒸30分钟，冷
却后接入种子液，摇匀，培养3～5天，米粒呈紫红色（胡开辉） *分为四大组，每组一个配方进行实验，配方e.、f.作为自选项 3．菌种活化
在净化操作台上操作。保藏于短梗霉多糖薄膜的保藏片，用灭过菌的剪刀将其外包装塑料膜剪开，再用灭过菌的镊子将里面的短梗霉多糖膜片夹出，置于装有100ml饴糖培养基的500ml三角瓶中，在恒温摇床上(28士1)℃，以200转速度震荡培养3天左右至瓶中浑浊有颜色变化有孢子生成（以上有教师作预备试
验）
4．平板单菌落
超净工作台擦拭干净，打开紫外灯提前灭菌15分钟至20分钟。 准备9个平皿、玻棒、推棒、1ml移液吸管头1包、9只试管分
别装9ml生理盐水，包扎灭菌（121℃,30分钟）好，放入净化操作台备用。（2人一组）
配制加有琼脂的饴糖培养基200ml，三角瓶中灭菌好（121℃,30分钟），放入净化操作台，待培养基冷却至50℃左右，将其分别平均倒入9个平皿中，待其冷却凝固。（操作前先点燃酒精灯，开启微风，倒平皿时要在酒精火焰的下风口进行操作，倒平皿速度要较快，否则琼脂凝固就会倒不出来）
将三角瓶中活化好的红曲孢子，用移液枪吸取1ml，放入其中1只装有9ml生理盐水的试管中，玻棒搅打均匀。再用移液枪吸取上述试管中的液体1ml放入装有9ml净化水的试管2中，依此类推，逐步稀释，至第9只试管。将上述试管中的第3、第4、第5、第6、第7，五只试管中稀释的孢子各吸取0.2ml，涂布在已经凝固好的平板上。从最稀的第7只开始涂布，到较浓的第3只。以玻棒推平，同样也是从最稀的开始逐个推平。置于恒温培养箱中28℃培养至明显的单个菌落出现且能观察到孢子生成。 5．种子培养
配制种子培养基②（加入一定数量的玻璃珠）121℃灭菌30分钟（2人一组），放入无菌操作台，待其冷却至常温，将上述平皿上长出的单个菌落上的红曲孢子挑取一环接入三角瓶种子培养基中（250ml三角瓶装量100ml，每组2瓶，其中一瓶用于取样观察，另一瓶则不取样留作种子），放置培养摇床上28℃～30℃，200rpm转速培养，每日在超净工作台上取样观察，至有较多的菌丝生成，将转速调整到160rpm，待有孢子生成即可作为种子。 6．发酵培养（事先将1ml吸管头包扎灭菌备用）
分为4大组（每大组做4瓶），分别配制大米粉培养基、小麦粉培养基、玉米粉培养基、木薯粉培养基，500ml三角瓶装量100ml，121℃灭菌30分钟，放入无菌操作台待冷却至常温。
在超净工作台上将上述培养好的种子培养液用移液枪吸取2ml，接种于已灭