第十五章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
15.1概述
高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid
Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较
经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高
分离能力，可以分离上百个组分。总体来看高效液相色谱法和经典液相色谱法主要有以下不同（见表15.1）。
表15.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较
方法
高效液相色谱法
项目
色谱柱 柱长/cm 柱内径/mm 固定相粒径/μm 筛孔/目 色谱柱入口压力/MPa 色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 进样量/g 分析时间/h 在线检测
可重复使用 10~25 2~10 5~50 250~300 2~20 2×10~5×10 10~10 0.05~1.0 能在线检测
-4-234经典液相色谱法 只用一次 10~200 10~50 75~600 200~30 0.001~0.1 2~50 1~10 1~20 不能在线检测
15.1.2与气相色谱法比较
气相色谱法具有高选择性、高分离效率、高灵敏度和分析速度快的特点，但它仅适用于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用范围大受限制。在全部有机合物中仅有20％的样品适用于气相色谱法分析。而高效液相色谱法却恰好弥补气相色谱法的不足，适合分离分析80%的有机化合物，广泛的用于天然产物、生物活性物质、生物大分子等有机物的分离分析。此两种方法的比较可见表15.2。
表15.2 高效液相色谱法与气相色谱法的比较
方法
高效液相色谱法
项目 进样方式 样品制成溶液 样品需加热气化或裂解 气相色谱法
流动相 （1）液体流动相可为离子型、极性、弱极性、非极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，并能改善分离的选择性 （1）气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用 （2）气体流动相动力粘度小，传输流（2）液体流动相动力粘度大，传输流动相压力高。 固定相 动相压力低 （1）分离机理：可依据吸附、分配、筛析、（1）分离机理：可依据吸附、分配两离子交换、亲和等多种原理进行样品分离，种原理进行样品分离，可供选用的固可供选用的固定相种类繁多 （2）色谱柱：固定相粒度小为5~10μm；填充柱内径为3~6mm，柱长10~25cm，柱效为10~10，毛细管柱内径为0.01~0.03mm，柱长5~10m，柱效为10~10； 柱温为常温 柱温为常温~300℃ 4534定相种类较多 （2）色谱柱：固定相粒度大0.1~0.5mm；填充柱内径为1~4mm，柱长1~4m，柱效为10~10，毛细管柱内径为0.1~0.3mm，柱长10~100m，柱效为10~10； 3424检测器 选择性检测器：UVD，PDAD，FD，ECD 通用型检测器：ELSD，RID 通用型检测器：TCD，FID（有机物） 选择性检测器：ECD*，FPD，NPD 可分析低分子量低沸点有机化合物；永久性气体；配合程序升温可分析高沸点有机化合物；配合裂解技术可分析高聚物 溶质在气相的扩散系数大，柱外效应影响较小，对毛细管气相色谱应尽量减小柱外效应对分离效果的影响
应用范围 可分析低分子量低沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子 仪器组成 溶质在液相的扩散系数很小，因此在色谱柱以外的死空间应尽量小，以减少柱外效应对分离效果的影响
注：UVD-紫外吸收检测器，PDAD-二极管阵列检测器，ECD-电化学检测器，ECD*-电子捕获检测器，ELSD-蒸发激光散射检测器，FD-荧光检测器，RID-折光指数检测器，TCD-热导检测器，FID-氢火焰离子化检测器，FPD-火焰光度检测器，NPD-氮磷检测器
15.1.3高效液相色谱法的特点
（1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱
的柱效可达2×103~5×104块·m-1理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103块·m-1理论塔板数的柱效。
（2）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物
及其同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。
（3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测器大多数具有较高的灵敏度。如使用广泛的紫外吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。
（4）分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。
15.2高效液相色谱仪
高效液相色谱仪自1967年问世以来，由于使用了高压输液泵、全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高灵敏度的分离测定。20世纪70~80年代高效液相色谱仪获得快速发展，并引入微处理机技术，极大地提高了仪器的自动化水平和分析精度。
高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能各异、应用范围不同，但其基本组件相似。现在用计算机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度高，既能控制仪器的操作参数（如溶剂梯度洗脱、流动相流量、校温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等），又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能全面的分析工具。图15.1为高效液相色谱仪的组成示意图。
图15.1 高效液相色谱仪结构示意图
高效液相色谱工作过程为：高压泵将贮液器中的流动相经过进样器带入色谱柱，当注入欲分离的样品时，流动相将样品一并带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器输出的信号记录下来，即得到色谱图，流动相和样品从色谱仪出口流出被馏分收集器收集得到。
以下分别介绍构成高效液相色谱仪的主要部件：贮液器、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、馏分收集器、记录仪和数据处理装置。
15.2.1贮液器
15.2.1.1简介
贮液器是用来存放流动相的容器，供给符合要求的流动相以完成分离分析工作。贮液器的材料应耐腐蚀、对洗脱液呈化学惰性，可为玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯等材料制成。容积大小与柱子的粗细、泵的种类以及所采用的液相色谱系统有关。一般容积约为0.5~2.0 L，以便在不重复加液的情况下能连续工作。对凝胶色谱仪、制备型仪器，其容积应更大一些。贮液器的放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程中贮液器应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。 高效液相色谱所用的溶剂在放入贮液器之前必须经过0.45μm的滤膜过滤，除去溶剂中可能含有的机械性杂质，以防输液管道或进样阀产生阻塞现象。对输出流动相的连接管路，其插入贮液罐的一端，通常要连有孔径为0.45μm的多孔不锈钢过滤器或由玻璃制成的专用膜过滤器。
15.2.1.2流动相脱气
高效液相色谱所用的流动相在使用前必须进行脱气，以除去其中溶解的气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时因压力降低而产生气泡，从而影响色谱柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线的稳定性，严重时无法进行分析。此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光淬灭现象，影响荧光检测器的检测，还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种：
（1）吹氦脱气法 使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在0.1MPa压力下，以约60mL·min-1的流速通入流动相10~15min以驱除溶解的气体。此法适用于所有的溶剂、脱气效果较好，但因氦气价格较贵，使用具有局限性。
（2）加热回流法 此法脱气效果较好，但操作较复杂，且有毒性挥发污染。