?
（15.10）
式中，
为胺基键合相，M为溶剂分子，x为溶质分子，
为溶剂化后的胺基键合固定相，
为溶剂化后的溶质分子，
表示平衡常数。
反相键合相色谱法的分离原理为，它使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理后与含烷基链（C4、C8、C18）或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基（或苯基）的非极性固定相。 关于反相键合相的分离机理目前有两种论点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设在由水和有机溶剂组成的混合溶剂流动相中，极性弱的有机溶剂分子中的烷基官能团会被吸附在非极性固定相表面的烷基基团上，而溶质分子在流动相中被溶剂化，并与吸附在固定相表面上的弱极性溶剂分子进行置换，从而构成溶质在固定相和流动相中的分配平衡。吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留是疏溶剂作用的结果。根据疏溶剂理论，当溶质分子进入极性流动相后，即占据流动相中相应的空间而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动与固定相接触时，溶质分子的非极性部分（或非极性分子）会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，而直接与非极性固定相上的烷基官能闭相结合（吸附）形成缔合络合物，构成单分子吸附层。这种疏溶剂的斥力作用是可逆的，当流动相极性减少时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并将溶质分子释放而被洗脱下来。
15.6.2固定相
在化学键合固定相的制备中广泛使用全多孔或薄壳型微粒硅胶作为基体。这是由于硅胶具有机械强度好、表面硅羟基反应活性高、表面积和孔结构易于控制的特点。在键合反应前，为增加硅胶表面参与键合反应的硅羟基数量来增大键合量，通常用2mol·L-1盐酸溶液浸渍硅胶过夜，使其表面充分活化并除去表面含有的金属杂质。据计算经活化处理的硅胶，每平方米约有 8μmol的硅羟基，但由于位阻效应的存在，在每平方米硅胶表面最多只有4.5μmol的硅羟基参加与其他官能团的键合反应，剩余的硅羟基被已键合上的官能团所屏蔽，形成所谓“刷子”结构。
根据键合有机分子的结构，用于制备键合固定相的化学反应可分为下列四种类型。
（1）
（硅胶与醇类的反应产物）
这类是首先用来制备键合相的化学反应，利用硅胶的酸性特性，使硅胶表面的硅羟基与正辛醇、聚乙二醇400等醇类进行酯化反应的产物。此时，在硅胶表面形成单分子层的硅酸酯。此类固定相有良好的传质特性和高柱效，但其易水解、醇解、热稳定性差，当用水或醇作流动相时，Si-O-C键易断裂，一般只能使用极性弱的有机溶剂作流动相，用于分离极性化合物。这些使它的应用范围受到限制。
（2）
（硅胶与胺类的反应产物）
这种键合相的热稳定性和化学稳定性均比酯化型要好，适于在pH=4~8 的介质中使用。
（3）
（硅胶与卤代烷的反应产物）
从氯化硅胶（反应B）开始，利用格氏试剂反应引入烷基。
从理论上讲，这种键合结构有更好的稳定性，特别是对微碱性的流动相，而且R基可以按要求多次氯化，形成聚烷基键合相，但制备比较困难。
（4）
（硅胶与有机硅烷的反应产物）
这是一类目前占绝对优势的键合相类型，具有良好的热和化学稳定性，能在pH=2~7.5的介质中使用。它是利用氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶的反应生成此类键合固定相。这也是制备化学键合固定相的最主要方法。
式中，X代表-Cl、-OCH3、-OC2H5等官能团；R1，R2可以是X，也可以是甲基。硅烷可以是单官能团或双、三官能团反应分子。
15.6.3流动相
在键合相色谱中使用的流动相和液-固色谱、液-液色谱使用的流动相有相似之处。在正相键合相色谱中，采用和正相液液色谱相似的流动相，在反相键合相色谱中，采用和反相液液色谱相似的流动相。常用流动相有：甲醇-水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲溶液等。
15.6.4应用
正相化学键合相色谱适合分离异构体、极性不同的化合物，特别适合分离不同类型的化合物。如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。反相键合相色谱法应用最广泛，因为它以水为主体溶剂，在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH 值和极性等，以提高选择性，而且流动相的紫外截止波长低（水为195nm、甲醇为205nm、乙腈为190nm），有利痕量组分的检测，反相键合相稳定性好，不易被强极性组分污染，且水廉价易得，安全。更换溶剂和梯度洗脱非常方便。一般来说，反向键合相色谱法适用于分离极性较小的样品，例如可以分离同系物、复杂的稠环芳烃以及其他亲脂性化合物，也用于药物、激素、天然产物及农药残留量等测定。
15.7 离子交换色谱法
20世纪40年代初，离子交换色谱作为一种分离技术用于分离稀土元素和裂变产物，对原子能工业的发展起了重要的作用。近年来随着高效液相色谱的飞速发展和各种新型离子交换材料的出现，高效离子交换色谱获得了很大的发展。目
前普遍采用新型离子交换剂，分离效率得到提高，应用范围扩大，一般可应用于离子化合物、能与离子基团相互作用的化合物（如螯合物和配位体）的分离。离子交换色谱解决了生化领域中许多重要而又复杂的分离分析问题，例如氨基酸、核酸的分离。一般说来，凡是能在流动相中离解的组分都可以用离子交换色谱法进行分离。离子交换色谱已在化工、医药、生化、食品等领域得到广泛的使用。
15.7.1原理
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）的固定相是离子交换剂（树脂），样品离子和离子交换树脂上带固定电荷的活性交换基团之间发生离子交换，不同样品离子对树脂的亲和力不同，相互作用力不同，作用力弱的在树脂上不易保留，首先被洗脱下来，而作用力强的则较长时间保留在树脂上，较晚洗脱下来，这样即可获得分离。离子交换树脂上所带电荷既可以是正电荷（阳离子交换树脂），又可以是负电荷（阴离子交换剂）。阳离子交换剂，多数带有磺酸基团，有时也有带羧基的，而阴离子交换剂，带有叔氨基或季铵基团。在这两种树脂上进行离子交换的过程分别为：
阳离子交换：R-Y+ + X+ = Y+ + R-X+
（15.11）
阴离子交换：RY + X= Y + RX
（15.12）
式中：式中X为待分离的组分离子；Y为流动相离子（也称为反离子）；R为离子交换树脂上带电离子部分。
如方程式（15.12）所示，在阴离子交换色谱中，样品离子X-与流动相离子Y-争夺离子交换剂上活性交换基因R+的位置。同样在阳离子交换色谱中，如方程式（15.11）所示，样品阳离子X+与流动相阳离子Y+争夺在离子交换剂上活性交换基团R-的位置。
15.7.2离子交换剂
离子交换剂的种类很多，大部分为有机物，如各种类型的合成树脂，也可以是无机物，如矿物质等。它们既可以是人工合成的，也可以是天然的，例如各种改性的纤维素、葡聚糖，琼脂糖的衍生物等。
+--
-+-
通常用聚苯乙烯和二乙烯基苯进行交联共聚生成不溶的聚合物基质，再对芳环进行磺化生成强酸性阳离子交换剂；或对芳环进行季胺盐化，生成带有烷基胺官能团的强碱性阴离子交换剂。离子交换剂上的活性离子交换基团决定着它们的性质和功能，除了上述两种离子交换基团外，目前已合成出了许多带不同强度和功能官能团的离子交换树脂。除此还有两性离子交换剂，在其基质中既含有阳离子交换基团，又含有阴离子交换基团。这类离子交换剂在与电解质接触中可形成内盐，通过用水洗的办法很容易使它们获得再生。
偶极子型的离子交换剂是一种特殊种类的两性离子交换剂，它们是通过把氨基酸键合到葡聚糖或琼脂糖上所制得的，它们在水溶液中可形成偶极子。这种类型的离子交换剂非常适合于那些能与偶极子发生选择性相互作用的生物大分子的分离。
螯合型离子交换剂所带的官能团可与某些金属离子形成络合物，这种整合型的离子交换剂比较容易与重金属和碱土金属进行络合。
尽管离子交换剂的种类很多，然而到目前为止，用得最多的仍然是以聚苯乙烯和二乙烯苯为基质的带各类官能团的离子交换剂，但它作为柱填充物有较大的溶胀性，不耐高压，表面积内部的微孔结构会影响溶质的传质速率。因此，近年来随着HPLC中以硅胶为基质的各种键合型固定相的出现和发展，以硅胶为基质的各种键合型离子交换剂的应用也越来越广。最常见的是在薄壳型或全多孔球型微粒硅胶表面键合上各种离子交换基团而制成的，主要类型见表15.3。
表15.3 以硅胶为基质的键合型离于交换剂
阳离子交换剂 键合基团 类型 强酸性 弱酸性 弱酸性 阴离子交换剂 键合基团 类型 强酸性 强碱性 强碱性 强碱性 中强碱性
两性离子交换剂 键合基团
弱酸性
以硅胶为基质的离子交换剂具有较好的化学稳定性和热稳定性，并能承受较高的压力。为了获得高分离效能，大多采用5~10μm的颗粒度，用匀浆法装柱。但由于硅胶本身不能在碱性条件下使用，因此一般说来必须在pH＜7.5的条件下使用。
15.7.3流动相