炭，近来开始使用的5~10μm的多孔石墨化炭黑以及高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的单分散多孔微粒（5~10um）和碳多孔小球（TDX）。
至今在液-固色谱中最广泛应用的是极性固定相硅胶。在早期经典液相柱色谱中，通常使用粒径在100μm以上的无定形硅胶颗粒，其传质速度慢、柱效低。20世纪60年代在高效液相色谱发展的初期，出现了薄壳型硅胶固定相，它是在直径约3~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm的硅胶层而制成的具有孔径均一、渗透性好、溶质扩散快的新型固定相，使液相色谱实现了高效、快速分离。但由于薄壳型固定相对样品的负载量低（＜0.1mg·g-1），70年代后迅速发展了全多孔微粒（5~10um）固定相。由于它们的粒度均匀、孔径均匀，装填在5~10cm的短柱，就可实现对样品的高效、快速分离，且对样品负载量较大，因此全多孔球形和无定形的硅胶微粒固定相已成为高效液相色谱柱填料的主体，获得广泛应用。
15.4.2.1表征固定相性质的参数
（1）粒度（dp）表示固定相基体颗粒的大小。对球形颗粒是用粒子直径（简称粒径，用dp表示）来量度的，对无定形颗粒系指它的最大长度。基体颗粒的大小可用标准筛来筛分。
（2）比表面积（SP）为每克多孔性基体所有内表面积和外表面积的总和，单位为m2·g-1。
（3）孔容（Vp）为每克多孔基体所有孔洞的总体积，单位为cm3 ·g-1或mL·g-1。 （4）孔度（孔率?）为多孔基体所有孔的体积在其总体积中占有的分数，它反映了基体的分离容量的大小。
（5）平均孔径（
）为多孔基体中所有空洞的平均直径。对于多孔基体，
所含不同孔洞的孔径分布呈正态分布曲线，平均孔径应位于孔径分布曲线的中间位置。
15.4.2.2 固定相的分类
（1）极性固定相 在极性吸附剂中，硅胶和硅酸镁为酸性吸附剂（表面pH=5）、氧化铝和氧化镁为碱性吸附剂（表面pH＝10~12)。最常用的硅胶吸附剂，其含水量对色谱分离性能有很大的影响。对于未经加热处理的硅胶，其表面游离型硅羟基皆被水分子覆盖，不呈现吸附活性。当将其在150~200℃以下加热、进行活化处理时，会除去一些水分子，使表面相邻的游离硅羟基之间形成氢键，而获得具有最强活性吸附中心的氢键型硅羟基，用于高效液相色谱的商品硅胶皆属于此种类型。若加热超过200℃，部分氢键型硅胶再脱水，就形成吸附性能很差的硅氧烷键型。对大孔硅胶上述活化处理过程是可逆的，对小孔硅胶此过程是不可逆的。若加热温度越过600℃，则硅胶表面皆成为硅氧烷键而失去吸附活性。
购置的商品硅胶吸附剂、表面皆为氢键型硅羟基，表现出很强的吸附活性，反而会引起化学吸附，造成色谱峰峰形拖尾，并延长吸附柱的再生时间。为消除此种不良影响，常向硅胶柱中加入少量极性改性剂，如在流动相中加入适量水，就可钝化最强的吸附活性中心，使其由氢键型硅羟基转化成对样品有适当吸附作用的游离型硅羟基。通常使每100m2吸附剂表面含水0.02~0.03g就可达此目的，为控制硅胶吸附剂的含水量，通常都采用含一定量水的流动相来使硅胶固定相的含水量达到平衡。
（2）非极性固定相 在非极性吸附剂中，高交联度（＞40％）苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球应用较广泛，另外用聚合物涂渍或包覆硅胶、氧化铝、氧化锆的新型非极性疏水固定相近年来获得快速发展。如在硅胶表面涂渍聚乙烯、氧化铝表面涂渍聚丁二烯等。这类固定相表现出既提高选择性，又增加了化学稳定性。在气相色谱中使用的石墨化炭黑和炭多孔小球，在液固色谱法中的应用中也开始探索，并受到愈来愈多的关注。
15.4.3 流动相
在高效液相色谱分析中，除了固定相对样品的分离起主要作用外，流动相的恰当选择对改善分离效果也产生重要的辅助效应。在液-固色谱法中，当某溶质在极性吸附剂硅胶色谱柱上进行分离时，变更不同洗脱强度的溶剂作流动相时，此溶质的容量因子k也会不同。在液固色谱法中，若使用硅胶、氧化铝等极性固定相，应以弱极性的戊烷、己烷、庚烷作流动相的主体，再适当加入二氯甲烷、氯仿、乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚等中等极性溶剂，或四氢呋喃、乙腈、异丙醇、甲醇、水等极性溶剂作为改性剂，以调节流动相的洗脱强度，实现样品中不同组分的良好分离。若使用苯乙烯二乙烯基苯共聚物微球、石墨化炭黑微球等非极性固定相，应以水、甲醇、乙醇作为流动相的主体，可加入乙腈、四氢呋喃等改性剂，以调节流动相的洗脱强度。
总之液-固吸附色谱法选择流动相的原则是：极性大的试样需用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性较弱的洗脱剂。常用溶剂的极性顺序由大到小排列如下：水（极性最大）、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、丁酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、溴乙烷、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环己烷、己烷、庚烷、煤油（极性最小）。
在液-固色谱法中，使用混合溶剂可获得最佳的分离选择性。此时，若混合溶剂中强极性溶剂的含量占绝对优势或含量很低，其分离因子α呈现最大值。此外若使用具有氢键效应的溶剂，如正丙胺、三乙胺、乙醚、异丙醚、甲醇、二氯甲烷、氯仿等作改性剂，则可显著改善色谱分离的选择性。使用混合溶剂的另一个优点是可使流动相保持低的粘度，并可保持高的柱效。如使用强极性乙二醇作改性剂。它的粘度高达16.5mPa·s，大大超过高效液相色谱允许使用的粘度
范围，但实际使用时，仅需将1%~2%的乙二醇加到弱极性溶剂中，就可获得洗脱强度高的混合溶剂，其粘度却符合高效液相色谱分析的要求。
15.5 液-液分配色谱法
15.5.1 原理
液-液分配色谱法简称液-液色谱法（liquid-liquid chromatography，LLC）。其流动相和固定相都是液体，又称分配色谱法，是在20世纪40年代由马丁（Martin A．J．P.）和欣格（Synge L．M．）提出的，是根据物质在两种互不相溶（或部分互溶）的液体中溶解度的不同而实现分离的方法。这一技术类似于溶剂萃取，实际上也可用溶剂萃取数据来预测LLC的分配系数。但LLC的分辨能力和速度则要大得多，因为当样品组分通过柱子时，就相当于多次分配作用。 在液-液色谱中当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，可由下式表示：
（15.9）
式中K是分配系数，cs和cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，Vs和Vm
分别代表固定相和流动相的体积。注意k与Vs成正比；增大固定液在载体上的涂敷量，样品的保留值也随之增大。
15.5.2 分类
根据固定相和流动相的相对极性而将这一技术分为两类。当固定相是极性而流动相是非极性时，称为正相LLC。溶质的洗脱顺序与LSC中在硅胶上所观察到的相似。非极性的溶质优先分配于流动相（cm高），呈现低的容量因子，并首先流出。极性溶质倾向于分配在极性固定相（cs高），呈现较高的容量因子，在后面流出。当固定相为非极性而流动相为极性时，即称为反相色谱法。溶质的洗脱
顺序虽不一定，但却常常同正相LLC中观察到的相反，即极性化合物首先流出，非极性的在后面流出。
15.5.3固定相
液-液色谱的固定相由载体和固定液组成。在高效液相色谱里，使用着两类不同的载体。一种为全多孔型材料（如硅胶、氧化铝），具有较大的比表面积和高的孔容。另一种为多孔层微珠（PLB），是在固体的核心上涂渍一薄层多孔活性涂层。多孔层的厚度通常为1~3μm。除涂渍硅胶和氧化铝以外，也可以涂渍离子交换树脂、聚酰胺等。这些材料都是耐压的。
理论上液-液色谱可供选择的固定液品种很多，但许多固定液能被常用溶剂溶解，只有不被流动相溶解或溶解度很小的固定液才有实用价值。因此只有少数固定液能用于液-液色谱，能作为固定液的首要条件是不溶于流动相。固定液一般是极性较高的醇，流动相是非极性的烃类，亦可加入少量卤代烷、四氢呋喃等构成正相色谱体系。
15.5.4流动相
分配色谱法所用的流动相的极性必须和固定相显著不同，否则会造成固定液的流失。在正相液-液分配色谱中，使用的流动相相似于液-固色谱法中使用极性吸附剂时应用的流动相。此时流动相主体为己烷、庚烷，可加入＜20%的极性改性剂，如二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈等，这样溶质的容量因子k会随改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度明显增强。 在反相液-液分配色谱中，使用的流动相相似于液-固色谱法中使用非极性吸附剂时应用的流动相。此时流动相的主体为水，加入＜10%的改性剂，如：二甲基亚砜、乙二醇、乙腈、甲醇、丙酮、对二氧六环、乙醇、四氢呋喃、异丙醇等。溶质在混合溶剂流动相中的容量因子k会随改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度增强。
15.6 化学键合相色谱
化学键合相色谱法（chemically bonded phase chromatography，CBPC）是在液-液分配色谱法基础上发展起来的。分配色谱法虽有较好的分离效果，但由于固定液是以机械的方法吸附在载体表面上，固定液流失严重，以致柱的使用寿命短，使柱效和分离选择性下降。流失的固定液会给基线带来大的噪声而降低检测器的灵敏度，同时也会污染分离后的组分。为了解决这一问题，人们将各种不同的有机基团通过化学反应的方法以共价键连接到色谱载体表面上，形成均一的、牢固的单分子薄层而制成化学键合固定相，进而发展成键合相色谱法。化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，特别适用于具有宽范围k值的样品的分离，并可用于梯度洗脱操作。至今键合相色谱法已逐渐取代液-液分配色谱法，并获得日益广泛的应用，在高效液相色谱法中占有极重要的地位。
根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，可将键合相色谱法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在正相键合相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离脂溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在反相键合相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性或离子型化合物，其应用范围比正相键合相色谱法更广泛。键合相已成为高效液相的一个重要组成部分，约70%~80%的分离和分析工作是由反相键合相色谱法来完成的，键合相的研制成功和应用被认为是高效液相色谱发展的一个里程碑。
15.6.1分离原理
键合相的基体目前主要用多孔微粒硅胶，根据在硅胶表面 （具有≡Si－OH基团）的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型 （≡Si－O－C ）、硅氧硅碳键型（≡Si－O－Si－C） 、硅碳键型（≡Si－C）和硅氮键型（≡Si－N）四种类型。化学键合固定相具有如下一些特点：表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析，例如键合氰基、氨基等极性基团用于正相色谱法，键合离子交换基团用于离子色谱法，键合 C2、C4、C6、C8、C16、C18、C22 烷基和苯基等非极性基团用于反相色谱法等；有利于梯度洗脱，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。因此，它是 HPLC 较为理想的固定相。
正相键合相色谱法的分离原理为，它使用的是极性键合固定相。它是将全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再与含有胺基（NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）的硅烷化试剂反应，生成表面具有胺基、腈基、醚基的极性固定相。溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱：