由于水是优良的溶剂，并且具有电离的性能，因此大部分离子交换色谱都是在水溶液中进行的。一般都采用水的缓冲液，以提供用以离子平衡的反离子，并使移动相保持一定的离子强度和pH值。有时也把少量有机溶剂如乙腈、甲醇、乙醇和四氢呋喃等加入到含水系统中，以便改进样品的溶解性能，并提出独特的选择性变化。有机溶剂的加入还可减小某些样品组分的拖尾现象，从而使待测样品得到良好分离。
在以水溶液为流动相的离子色谱中，缓冲液浓度直接影响着离子平衡。和在液-固色谱、液-液色谱中的情形相类似，缓冲液浓度的增加，会降低样品组分的保留，这是因为流动相中反离子浓度的增加，增强了它与样品离子争夺树脂上离子交换基团的能力，从而减弱了样品组分与离子交换树脂的亲和性。
缓冲液强度的上限取决于流动相中缓冲液盐的溶解性。要避免使用接近饱和的缓冲液浓度，因为若产生盐的沉淀，会造成液相色谱系统的堵塞。其下限由缓冲容量所决定，如果缓冲液太弱，则无法控制流动相的pH值。
流动相中的离子类型能对样品分子的保留产生显著的影响，因为不同的流动相离子与离子交换树脂相互作用的能力是不同的。在离子交换色谱中，广泛使用磷酸、醋酸、柠檬酸、硼酸和甲酸的钠盐、钾盐和铵盐。它们通常与其相应的酸相混合以作酸性缓冲液用，或者把这些盐与NaOH、KOH等混合，用作碱性缓冲液。一般要尽量避免使用盐酸盐，因其对许多仪器的钢材有腐蚀作用。
在离子交换色谱中，还可通过改变流动相的pH值来控制溶质的保留，因为pH值能影响样品分子的解离程度，从而影响它们与离子交换剂相互作用的强弱。
15.7.4应用
离子交换色谱首先被用于无机物的分离，尤其是核裂变产物的分离。目前利用离子交换色谱不仅可以分离碱金属、碱土金属、稀土元素、镧系和锕系元素及许多重金属，而且许多无机和有机阴离子也可用其进行分析。随着各种新型、高效离子交换剂的研制成功和衍生化技术检测方法和手段的发展，离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核糖核酸、有机胺、有机酸糖类及药物等方面的应用越来越广。
15.8 尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱（exclusion chromatography，EC）简称排阻色谱法，也称凝胶色谱法（gel chromatography）或分子筛色谱法（lecular sieve
chromatography）。排阻色谱法不是根据组分在两相间作用力不同而进行分离，而是依据组分分子体积（流体力学体积）或分子大小而分离。它主要应用于高分子化合物的分离和合成聚合物分子量分布的测定，在生物化学和高分子领域中得到广泛的应用。排阻色谱法的分离机理是简单而明确的，在样品和固定相的表面之间无相互作用的情况下，洗脱次序（或洗脱体积）完全是根据分子的大小。
15.8.1原理
排阻色谱法采用具有一定孔径分布的多孔性情性物质作为柱填料。柱填料与流动相平衡后，孔内充满着流动相。当样品溶液随流动相流过色谱柱时，比填料最大孔径还大的样品分子不能扩散进入填料孔内，完全被排阻在填料之外，随流动相直接流出色谱柱，比填料最小孔径还小的分子可以扩散进入填料的所有孔内，最后流出色谱柱，中等大小的分子可以进入填料的部分孔内，流出色谱柱的顺序居中。分离过程模型见图15.20。
图15.20 凝胶色谱分离过程模型
由于排阻色谱法的分离原理不是取决于组分与固定相和流动相的相互作用，所以不需用梯度洗脱，实验操作比较简单，重现性好，出峰顺序可以预测，但不能分离具有相同或相似大小的分子，峰容量有限。排阻色谱法可用来分离那些因溶解度、极性、吸附或离子特征无足够差异的高分子化合物，这类化合物不能用其他高效液相色谱法进行分离，排阻色谱还可以分离大分子混合物。
15.8.2固定相
排阻色谱法分析中使用的柱填料（固定相）一般为凝胶，除了要求热稳定性、机械强度和化学情性外，在选择凝胶时还应考虑排阻极限、分离范围、固定相流动相比和柱效，这些都与凝胶的孔径大小分布有关。
某些高交联聚苯乙烯胶和聚合胶可以在高达50个大气压下使用。硅胶或多孔玻璃具有刚性骨架的耐压固体，也可以应用于高压条件下的排阻色谱法。这些材料比起软胶来说具有某些优点：填充比较容易，不需要放在洗脱液中作预先溶胀，且能获得机械性能稳定的柱子（即渗透率与外加压力无关）。在实际应用中，可以使用多种洗脱液，因为填料不需要进行充分的溶胀。又因溶胀度不变，就能够方便地更换洗脱液。这就增加了这种方法的优点和多用性。另一个优点在于这些填料和它们的孔结构适用于所有有机溶剂，甚至在高温下也是如此。例如，在表征聚烯烃的特性时，这一点是非常重要的。
硅胶的孔径也可以做到2nm到2500nm的范围。dp约为10μm或更小些的球形硅胶，其平均孔径为6nm至400nm，可用来分离大多数一般的高聚物。分子量小于1000的物质可用孔径为6nm的硅胶来分离，而当孔径为400nm时，即使是分子量为7×106的高聚物标样也不能被全部排阻。平径孔径约为25nm的硅胶能够分离分子量范围为2000到100000左右的聚苯乙烯样品。
这些极性固定相的缺点在于它们的吸附特性。在很多情况下，通过适当地选择洗脱液可以限制它们的活性。聚苯乙烯则用四氯化碳吸附在硅胶上，而在二氯甲烷、四氢呋喃和二甲替甲酰胺中则被排阻，即它们是基于其分子的大小而被分离的。硅胶表面用三甲基氯硅烷化处理能够消除任何产生干扰的残余基团活性。如果有更多的碳被键合到表面上，如同反相系统那样，则孔容随着被键合碳的数量成比例地减少。
15.8.3流动相
在排阻色谱法中，流动相的作用原则上不像在其它各种液相色谱方法中那样重要，这是由于它的分离并不依赖于样品组分与填料及流动相之间的相互作用，因此对于流动相的选择考虑就显得较为简单，主要要求粘度低、沸点高、能溶解多种大分子样品、能润湿填料。实验中，为了减小溶剂粘度（以降低柱压）和增加样品的溶解度，色谱柱温度常常高于室温；另一方面，流动相必须与所选用的检测器相匹配；在用示差折光检测器时要求流动相的折光指数与样品的折光指数有尽可能大的差别，以得到较高的灵敏度；在用紫外分光光度检测器时，则流动相本身应有较低的紫外截止波长（所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过
溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。）或者至少在所选检测样品的波长处，对于流动相来说应是“透明”的。
在排阻色谱中较为常用的溶剂有甲苯、四氢呋喃、卤代芳烃等，其中尤以四氢呋
喃最为理想、最常用，但四氢呋喃在贮存时很易产生过氧化物，在日光下生成更快，在蒸馏提纯四氢呋喃时，不能蒸干，否则容易引起爆炸。
15.8.4应用
排阻色谱法广泛用来测定高聚物的分子质量和各种平均相对分子质量，可以分离从小分子至相对分子质量达106以上的高分子，可以很容易的分离低相对分子质量添加剂及反应物，可对未知物进行初步探索分离。例如可对蛋白质、核酸、油脂、添加剂等样品进行分离分析。
15.9 色谱分离方法的选择
高效液相色谱中几种分离方法都有各自的适用范围，具体选用哪一种分离方法比较合适这决定于样品的性质，如分子量范围、溶解度、官能团类型和其数量等，由红外、紫外、核磁等数据可获得样品的有关信息，有助于选择分离方式。若组分分子量大于2000，应采用排阻色谱法，若样品溶于水，则以水溶液为流动相，若样品溶于有机溶剂，则相应的溶剂可用作流动相；若分子量小于2000，首先应确定样品是否溶于水，若样品溶于水，可考虑用离子交换色谱法、离子色谱法或反相键合相色谱；若样品不溶于水，但溶于有机溶剂，可考虑用键合相色谱或吸附色谱，若样品溶于中等极性或强极性溶剂，应选用非极性或弱极性固定相，若溶于非极性溶剂，则应采用极性固定相。分离方式选择的一般原则如下：
分离方式确定后，可以选择固定相，高效液相色谱中70%以上的分离工作是用反相键合相色谱完成的，流动相与固定相之间存在一定的配比关系。根据分析样品的实际情况，同时借鉴相关文献资料，结合实验室条件，可制定出合适的分离分析条件。但在高效液相色谱中，即使固定相、流动相条件与文献的条件完全一致，也不一定能得到相同的分离效果，必须根据自己的实验来确定最佳条件。
15.10 高效液相色谱法的应用实例
高效液相色谱法经过几十年的发展，在色谱理论研究、仪器研制水平和分析实践应用等方面，已取得长足的进步。高效液相色谱应用很广，尤其适合分离分析不易挥发、热稳定性差和各种离子型化合物。例如分离维生素、氨基酸、蛋白质、糖类和农药等。
[例15.1] 高效液相色谱法测定灰叶胡杨花粉样品中17种氨基酸。 解：
分析样品：灰叶胡杨花粉 分析项目：17种氨基酸