图15.6 脉动阻尼器
15.2.2.4梯度洗脱装置
高效液相色谱洗脱技术有等强度（isocratic）和梯度（gradient）洗脱两种。等强度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定不变，适合于组分数目较少、性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内由程序来控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。在分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时须采用梯度洗脱技术、使所有组分都在适宜条件下获得分离。梯度洗脱能缩短分析时间、提高分离度、提高柱效、改善峰形、提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。
梯度洗脱的方法是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分在最短的分析时间内获得较好的分离效果。当样品中第一个组分的k值和最后一个峰的k值相差几十倍至上百倍时，使用梯度洗脱的效果就特别好。此技术相似于气相色谱中使用的程序升温技术，现已在高效液相色谱法中获得广泛的应用，有两种实现梯度洗脱的装置，即高压梯度装置和低压梯度装置。
（1）低压梯度（外梯度） 在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）通过梯度比例阀按程序混合，然后再用高压输液泵送入到色谱柱中，其装置图15.7所示，此法的主要优点是仅需使用一个高压输液泵。
如对二元混合溶剂体系，操作时先将弱极性溶剂A，通过由微处理机控制的低压计量泵和时间比例电磁阀（6）直接流入混合器；强极性溶剂B，也通过低压计量泵，并由微处理机控制另一时间比例电磁阀（7）的开关时间，来调节流入混合器的B溶剂的体积百分数、以控制输出混合溶剂的组成。溶剂A和B在混合器内充分混合后，再用高压输液泵输至色谱柱。通过预先设定溶剂A、B时间比例电磁阀的开启时间，就可控制二元混合溶剂流动相的组成，并连续输出具有不同极性的流动相。此种梯度洗脱方式可以减小溶剂可压缩性的影响，并能完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化所带来的误差。
（2）高压梯度（内梯度） 目前，大多数高效液相色谱仪均配有高压梯度装置，它是用两台高压输液泵分别将两种溶剂A、B输入混合室，进行混合后再送入色谱柱。两种溶剂进入混合室的比例可由溶剂程序控制器或计算机来调节。此类装置如图15.8所示，它的主要优点是两台高压输液泵的流量可独立控制，可获得任何形式的梯度程序，且易于实现自动化。
由于高压梯度装置中，每种溶剂是分别由泵输送的，进入混合器后，溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积的变化，可能影响输入到色谱柱中的流动相的组成。在梯度洗脱中为保证流速稳定必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。
图15.7 低压梯度装置图 图15.8 高压梯度装置图
1.低压计量泵 2.微处理机 3.混合器 1.程序控制器 2.溶剂A 3.溶剂B 4.高压泵A 5.高压泵B
4.高压输液泵 5.至色谱柱 6、7.时间比例电磁阀 6.反馈控制器 7.混合室 8.流量计信号 9.混合溶剂出口
（3）梯度洗脱曲线 梯度洗脱时常用一个弱极性溶剂A和一个强极性溶剂B组合。以梯度洗脱时间作横坐标，以流动相中强极性组分B的体积百分含量作纵坐标，可绘出梯度曲线。若在单位时间内，强极性溶剂B在流动相中的体积百分含量以恒定的速率增加，则流动相的极性呈“线性梯度输出”，若不以恒定速度增加，流动相呈现凸形或凹形输出，如图15.9所示。
当梯度洗脱方式确定后。对应于不同梯度洗脱形状，获得的色谱分离图如图15.10所示。若呈线性梯度洗脱，如图15.10（b），谱图中每个谱带宽度相等，且各个谱带间具有相同的分离度。若呈“指数形式”的凸形洗脱，如图15.10（a），在分离开始时，B的体积百分含量迅速增加，使各组分谱带以较低的平均容量因子k值洗脱，并且最终谱带的k值也较低，使开始被洗脱的色谱峰形尖锐，且分离度减小；而在分离的后期，B的体积百分数增长减慢，使后被洗脱的色谱峰谱带加宽，分离度增大。若呈“指数形式”的凹形洗脱，则如图15.10（c）所看到的谱图变化与图15.10（a）恰好相反。即开始被洗脱的色谱峰谱带较宽，分离度较好，而后洗脱的色谱峰谱带较尖锐，分离度减小。
图15.9 梯度洗脱形状 图15.10 梯度洗脱的形状及对分离的影响
（4）影响梯度洗脱的因素 进行梯度洗脱时，选定溶剂A、B之后，设定梯度速度和梯度时间，确定梯度曲线形状，要以最经济的梯度洗脱程序，实现样品的最佳化分离。影响梯度洗脱的因素有：溶剂的纯度要高，否则会使梯度洗脱的重现性变坏；梯度混合的溶剂互溶性要好，应防止不互溶的溶剂进入色谱柱、应当注意溶剂的粘度和相对密度对混合流动相组成的影响；梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如折光指数检测器）。
15.2.3进样装置
进样装置是将分析样品引入色谱柱的装置，要求重复性好，死体积小，保证中心进样，进样时色谱柱压力、流量波动小，便于实现自动化等。高效液相色谱中的进样方式可分为隔膜进样、阀进样、自动进样器进样等。
15.2.3.1隔膜进样
用微量注射器针头穿过橡皮隔膜进样，这是最简便的一种进样方式。而且由于可以把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，所以往往可获得最好的柱效。但是由于这种进样方式不能在高压下使用（如10MPa以上），重复性较差（包括柱效和定量结果），加之能耐各种溶剂的橡皮材料不易找到，因而常规分析使用受到局限。
15.2.3.2阀进样
这是目前高效液相色谱普遍采用的一种进样方式。虽然由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率稍低于注射器隔膜进样，但因耐高压，重复性良好，操作方便，因而深受色谱工作者的欢迎。其中，图15.11所示的六通进样阀最为常用。此阀的阀体用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能又好。当进样阀手柄置取样位置（a），用特制的平头注射器吸取比定量管体积（5μL或10μL）稍多的样品从注入口处进入定量管，多余的样品从出口排出。再将进样阀手柄置进样位置（b），流动相将样品携带进入色谱柱。此种进样直观性好，能耐20MPa的高压。
图15.11 六通阀进样示意图 （a）取样位置 （b）进样位置
15.2.3.3自动进样器
自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按预先编制注射样品的操作程序工作。操作者只需把装好样品的小瓶按一定次序放入样品架上，然后取样、进样、复位、样品管路清洗等全部按预定程序自动运行，一次可进行几十个或上百个样品的分析。自动进样的样品量可连续调节、进样重复性高，适合作大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。
15.2.4色谱柱
色谱柱被称为高效液相色谱仪的“心脏”，因为色谱的核心问题—分离是在色谱柱中完成的，色谱柱的设计（包括柱型、结构、填料和装填方法）或称柱技术（Column technology）对现代液相色谱的发展起着关键性作用。为了适应不同的分离分析要求，色谱柱有不同的柱型，不同的柱材料及规格。
15.2.4.1柱材料
常用内壁经过精密加工抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。不锈钢管耐溶剂、水和缓冲溶液的腐蚀，使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。此外也有使用氟塑料、玻璃和玻璃衬里材料作色谱柱的，主要从抗腐蚀和易加工两方面来考虑。
15.2.4.2柱结构
一套完整的色谱柱，除柱管外，还应有柱头及配套的连接管。一般色谱柱是由柱管，末端接头，卡套（又称密封环）和过滤筛板等组成的。图15.12是目前较为流行的典型分析型高效液相色谱柱的结构。
图15.12 高效液相色谱柱结构示意图
15.2.4.3柱规格
—般采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为4.6mm或3.9mm，长10~50cm，填料粒度5~10μm时，柱效达5000~10000块·m-1理论塔板数。使用3~5μm填料，柱长可减至5~10cm。当使用内径在0.5~1.0 mm的微孔填充柱或内径为30~50μm的毛细管柱时，柱长为15~50cm。
当使用粗内径短柱或细内径长柱时，应注意由于柱内体积减小，由柱外效应（是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的成因，主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生）引起的峰形扩展。此时应对进样器、检测器和连接接头作特殊设计以减少柱外死体积。
15.2.4.4柱连接方式
柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料制成，此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，可阻挡流动相中的极小的机械杂质以保护色谱柱，但流动相可顺利通过。柱入口、出口的连接管的死体积愈小愈好，一般常用窄孔（内径0.13mm）的厚壁（1.5~2.0mm）不锈钢管，以减少柱外死体积。
15.2.4.5柱温控制
高效液相色谱在以下几种情况须精确控制柱温：在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性；必须通过改变柱温来提高分离效率；对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温；对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室温，防止活性成分失活；对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，需要使用二维色谱技术；利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温下操作，以实现多组分的完全分离。
一个理想的HPLC柱温控制系统可以实现从低于室温10 ℃至80 ℃柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱仪，其柱温可从室温至150℃实现精确控温。