18、各种规格的无菌量筒(100 ml - 2000 ml 19、无菌的吸管(2 ml - 50 ml
20、保护性手套(无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套 21、防热性手套 22、冰盒 脉冲场凝胶电泳
（PFGE ，Pulsed Field Gel Electrophoresis ）是一种分离大分子DNA 的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA 分子（>10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA 分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb 到10Mb 的DNA 分子。
高分子量DNA 琼脂糖凝胶块制备和加工
1．收集10ml 全血，加入30ml 细胞裂解液。置冰浴中至少20min 直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min ，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS 重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer 腔计数细胞。
4．用PBS 重悬细胞，以达到40μl PBS 中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg ）
5．用PBS 配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积（各1ml ）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min 让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K 。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K 缓冲液于50℃保持2～3天。每个盛有50ml 蛋白酶缓冲液的Falcon 管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K 消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10． 此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE 缓冲液冲洗数遍的步骤。 11． 将凝胶块放入装有TE 及0.04mg/ml PMSF 溶液的Falcon 试管中，灭活残留的蛋白酶K 。
12． 室温下用TE 溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L
EDTA ，（pH8.0）4℃保存凝胶块。
13． 若用EDTA 保存凝胶块，取出后应用TE 溶液室温下漂洗30 min×2次。 大小标准物的制备 λ多联体
1．以TE 缓冲液悬浮λ 4μg/40μl 。
2．用等体积TE 配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。 3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE 及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
酵母染色体
1．从YPD （酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD 预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h （产量大约100块）。
2．4000×g转速，离心10min ，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5溶液悬浮。
3．仍以4000×g转速离心10min ，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/L 多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为
EDTA (pH7.5]溶液重悬。
4．取稀释后的细胞悬液用Neubauer 腔计数。
5．溶液短暂离心后，再用SCE 重悬细胞，使40μl SCE 溶液中含5×107个细胞（相当于80μl 体积的模块中含有5×107个细胞）。
6．溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T 和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀，37℃保温15～30min 。
7．细胞悬液与等体积的SCE 配制的2％低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50℃。
8．将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。
9．凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE 溶液37℃下振荡温育1～2小时。
10． 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K ，50℃温育48h 。
11． 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5溶液洗涤凝胶块3次，每次20min 。
12． 凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。 琼脂糖凝胶块中DNA 的限制性内切酶消化
1．应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA 降解。
2．在Falcon 试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA 。 3．混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100
mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），10～20单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。
4．设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA 降解。
5．将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。
6．若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求50℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。
7．若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。
1．将0.8％的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50～60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。
2．凝胶固化后小心地拔出齿梳，用
2把无菌手术刀将DNA 凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA 大小标志物上样至凝胶的两旁。
3．用1％液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25×TBE配制）密封狭槽。 4．若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。
5．一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min ），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。
6．应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。
7．电泳结束后，凝胶用0.25×TBE配制成的EB （0.4μg/ml）染色。 8．用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。 9．凝胶成像：DNA 在曝光的过程中可能会形成缺口。
10． 用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min ，让DNA 脱嘌呤，并有利于转移。 11． 凝胶用碱（变性溶液中）变性20min ，两次，续以中性溶液1～5min 。 12． 采用标准Southern 印迹方案将DNA 转印至尼龙膜上。一般来说，印迹PFGE 凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约48h ）。
脉冲场凝胶电泳（PFGE'S Agarose）