PFGE'S Agarose有以下两种：
一、InCert 琼脂糖----兆碱基片断DNA 制备获准使用的琼脂糖。 LONZA 公司 InCert琼脂糖
是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA 样品的低胶凝温度琼脂糖。研究
证实InCert 琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA 的制备和限制性核酸内切酶消化。 ⊙应用：脉冲场凝胶电泳。
⊙分析说明：胶凝温度（1.5%）:26℃－30℃ 硫酸盐：≤0.15% 凝胶强度(1.0%：≥400g/cm2 熔化温度（1.5%）：≤70℃ 湿度：≤10% EEO(-Mr：≤0.10 二、SeaKem Gold琼脂糖 LONZA 公司 SeaKem Gold琼脂糖
是一种高凝胶强度，低EEO ，标准胶凝温度的琼脂糖。这种遗传学术级别（Genetic Technology Grade，GTG ）琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法（pulsed field gel electrophoresis ，PFGE ）快速分辨Mb （megabase ））50kb-10Mb ）DNA 和常规电泳方法分辨1-50kb 的DNA 与PCR 产物。因其低EEO 特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA 电泳迁移速度要显著的高于常规琼脂糖凝胶。PFGE 的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度的不同可减少至原电泳时间的50%。因其高凝胶强度，即使是使用低浓度（0.5%）的SeaKem Gold 琼脂糖凝胶，操作处理依然很方便，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA 片断并减少PFGE 中的DNA 分离的耗时。
⊙应用：脉冲场凝胶电泳； 标准凝胶电泳分离大于23kb 的DNA 片断；Mb 大小DNA 印迹。
⊙分析说明：
胶凝温度（1.5%）:34.5℃－37.5℃ 硫酸盐：≤0.10%
凝胶强度(1.0%：≥1800g/cm2 凝胶强度（1.5%）：≥3500g/cm2 湿度：≤10% EEO(-Mr ：≤0.05
PFGE 步骤 1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备
为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus
aureus 作为例子。
1 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g 离心5min 。
2 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min 。之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。
3 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC
缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。
对于每一个菌株，需要15～20 个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase 的10mL EC
缓冲液中，于37℃振摇过夜。
5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50℃轻度振摇温育48h 。 6 将凝胶块放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次 ，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。
7 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次 ，置于TE 中4℃保存。 2. 限制酶消化
提高PFGE 的分辨率取决于100～1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。（生物秀实验频道
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125μL10× 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250μL 混匀。
2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求 后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。
3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析
1 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell
进行电泳的话，50mL 该溶液即可。
2 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以l:1
的比率与 50℃2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中 。
3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。
4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain或打开变速泵至40。
5 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb
的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1下得以分离，时间为3～5h 。
6 在 0.5μg/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。 4. 分离、纯化大的DNA 片段
1 凝胶染色、分析后，在目的带前(靠近正极处 切一个 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。
2 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA 的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。
3 加入2μL 的tRNA ，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保温10min 。
4 苯酚/氯仿500μL 抽提两次。
5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2 于-70℃10min 沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE
缓冲液中。