山东农业大学学士学位论文
1981 tcttacttcg tcgagtggat ccccaacaat gtccagaccg ccctctgctc cattcctccc 2041 cgcggcctca agatgtcctt cacctttgtc ggtaactcta ccgccatcca ggagctcttc 2101 aagcgtgtcg gtgagcagtt cactgccatg ttccgtcgca aggctttctt gcattggtac 2161 actggtgagg gtatggacga gatggagttc actgaggctg agtccaacat gaacgacttg 2221 gtctctgagt accagcagta ccaggacgct ggtgttgatg aggaggagga ggagtacgag 2281 gatgacgccc ccctggagga ggaggtttaa gcgttgtctg aaaatgctgt gccaccttgg 2341 ccatgtcttc acccaacccg tctgcggtgg catttcgctt cactattcca gctctgcact 2401 ggaaatgggc ttctagatat acctctctta gtagttcgcc tggcgtatca aaatgagtac 2461 gaagaatcag agattactct gtacaaatta ttggcaacat caaatgcata gttttatggc 2521 aattgcgaca cctctaatct tgccagagtt caagtattcg tatcttcttt cgtgactgac
2581 agattatcta tgtttaaacg tggacaccct cgag
2.3.5 运用SIM4进行基因结构分析
方法：
首先进入Google的官网http://www.google.com.hk/,在查询框中分别键入SIM4，点击Google搜索,找到SIM4 - a program to align cDNA and genomic DNA - pBil，点击进入,然后选择需要对比的基因，截其中从ATG到下引物的部分, 输入框中，点击左下方SUBMIT进入，然后选择1中SIM4点击，即可出现序列之间的对比图[15]，其它序列的寻找同上。
3.结果与分析
结果：蓝色为内含子，黑色为外显子，红色为上下引物。
第一行是>CH063_01300，第二行是>GLRG_08786，第三行是>um05828，第四行是>sr16450。
1-353 (1-341) 80% == 409-806 (398-795) 90%
ATGCGTGAGATCGTAAGTGGTCTTCTCTCCTGTCCATCAGTC--AACACA ATGCGTGAGATTGTAAGT—CCTTC-C-CC—TCAATCATTCGTAACA-A
ATGCGTGAGATT-------------------------------------- ATGCGTGAGATT-------------------------------------- ***********
ACAAACCTGCGAC-G-CGTCG---GACGACAAATAATTGGGCTTGCCCCT ATAAACCTGCGACCGACG-CGTTTGGCGACGAATCGTCGGCCTTGCCCCT
-------------------------------------------------- --------------------------------------------------
GAGCAAACCCCGCCGACATTTCCACTCAACGCCGGCCCTCACCGAACACG
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GAACGTACCCCGCCGACATTTCCACCCAACACTGGTCCTCACCGAAGACG
-------------------------------------------------- --------------------------------------------------
GCCGCGAT-GCCATCACCAACTGCGCT-CACCTTGGGGATATCTTGCTGA ACCACGATTGCCATCACCGACAG-TATGCACCTTGGGGATATATCGCTGA
-------------------------------------------------- --------------------------------------------------
CTTTTCTTTCTTCCTCTCTCGATAGGTTCACCTTCAGACCGGCCAGTGCG CCATTGATTGTT-AT-ACTCGATAGGTTCACCTCCAGACCGGCCAGTGCG
-------------------------GTCCACCTTCAGACCGGTCAGTGT- -------------------------GTCCACCTTCAGACCGGTCAGTGT- ** ***** ******** *****
TAAGTCTCTCCTGATAGATGCTGCCGACCCAACGAATCTCA--GTGCGGG TAAGTCT-TC-T-CT-GAT-C—CC-AACCAAC-AATC-CAAGGTGCGGG
-------------------------------------------------- --------------------------------------------------
Primer beta-tubulin 2a
GCTAACCTTTCTTCGAATAGGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTTTGGTGC GCTAA-C-TTCTTTGAATAGGGTAACCAGATTGGTGCTGCCTTTTGGTGC
--------------------GGTAACCAGGTCGGTACCAAGTTCTG---- --------------------GGTAACCAGGTCGGTACCAAGTTCTG---- ********* * *** * **
GTAGCCAGACCGACACCGTATAAAGGAAACAACTCATTGACTGAGGCGTT GTAGCCAGACCGACAGGGGATAAAAGACATTGGATATTAATACAGGCACC -------------------------------------------------- -------------------------------------------------- * * ***** ** * *** * ****
AGGCAAAACATCTCTGGCGAACACGGCCTTGACAGCAATGGCGTGTATGT AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCACGGCCTCGACAGCAATGGCGTGTATGT TGGGAAGTGCTCTCGGACGAACATGGCATCGACCACAACGGTAA------
TGGGAGGTGCTCTCGGACGAGCACGGAATCGACCACAACGGTAA------
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TGTCGACCTCCTGATCAGGCC-TGACCGCGAATTCACCGCTAATCCCCC
TGCCAACCTCCAGATCTGGCCACT-CCTCGAGTTCACCGCTAAT--TTC ------------------------------------------------- -------------------------------------------------
CCAACAGGTACAACGGCACCTCTGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTC TCAACAGTTACAATGGCACCTCTGAGCTCCAGCTCGAGCGCATGAGCGTC
-------CTACATTGGCACCAGCGACGACCAGCTCGCCCGCATCAATGTC -------CTACATCGGCACCAGCGACGACCAGCTCGCCCGCATCAACGTC
TACTTCAACGAAGTTTGTCATCCTAGTCCCCC—AGTGT-GCAGATAAAC TACTTCAACGAAGTTTGTTATCCTAGCCCCCCCCAG-GAAGCAGACAAAC
TACTACAATGAG-------------------------------------- TACTACAATGAG--------------------------------------
CTATTGACGAATACTGACCTTCTCACTTAACCAGGCTTCCGGCAACAAGT CTATTGATGAATACTGACCTTGTCACGTACCCAGGCTTCCGGCAACAAGT
----------------------------------GCCAGCGGAAACAAGT ----------------------------------GCCAGCGGCAACAAGT ** *** *******
ATGTCCCCCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCT
ATGTCCCTCGCGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGATGCT ATGTGCCGCGTGCCGTGCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACTCT ACGTGCCCCGTGCCGTGCTCGTCGACCTCGAGCCCGGCACCATGGACTCG * ** ** ** ***** ********* * ******** ******** *
GTCCGCGCTGGCCCCTTCGGCCAGCTCTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTT
GTTCGCGCCGGCCCCTTCGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTT ACCCGTTCGGGTCCTCTTGGTGGACTTTTCCGCCCAGACAACTTTGTGTT ACGCGTTCCGGCCCGCTCGGCGGCCTCTTCCGCCCCGACAACTTTGTCTT ** * ** ** * ** ** ******** ******** ** **
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Primer beta-tubulin 2b
CGGCCAGTCTGGTGCCGGCAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACCGAGG
TGGCCAGTCCGGTGCCGGCAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACCGAAG TGGTCAGTCGGGTGCCGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACCGAGG TGGTCAGTCCGGTGCCGGCAACAACTGGGCCAAGGGCCACTACACCGAGG ** ***** ******** ***************** *********** *
GA GA GT GT *
分析：通过五个基因与系统发育相关的基因在黑粉菌和炭疽菌之间的差异的比较，我们发现：
1、黑粉菌中缺失内含子，剩余外显子部分匹配相当紧密，两序列无区别可以让我们分出它们分别来自玉米黑粉菌和玉米丝黑穗菌；
2、炭疽菌里既有内含子，又有外显子，外显子部分匹配也是相当紧密，但内含子上下两个不同种之间具有较多差异和变化，是为分类的依据 [18]。
3、图中切掉内含子的四个序列对比，只剩下外显子的序列匹配高度一致。
验证：利用图中已标出的上下引物，对上述四个片段进行PCR扩增，得到多拷贝，再进行测序、验证，得到与分析一致的结果。
4、炭疽菌属于子囊菌，黑粉菌属于担子菌，担子菌比子囊菌高等。炭疽菌和黑粉菌对比，炭疽菌缺失内含子部分，外显子序列高度保守，证明内含子可以作为炭疽菌分类的依据，而黑粉菌在进化过程中进化掉了内含子，所以内含子不能作为炭疽菌分类的依据。
4. 讨论
seq1=>CH063_01300，seq2 =>GLRG_08786。 内含子①： >Seq1 (204 nucleotides)
>Seq2 (202 nucleotides)
24-182 (18-184) 77%
24 ATCAGTC—AACACAACAAACCTGCGAC-G-CGTCG---GACGACAAATA 18 ATCATTCGTAACA-AATAAACCTGCGACCGACG-CGTTTGGCGACGAATC **** ** **** ** *********** * ** ** * **** ***
67 ATTGGGCTTGCCCCTGAGCAAACCCCGCCGACATTTCCACTCAACGCCGG 66 GTCGGCCTTGCCCCTGAACGTACCCCGCCGACATTTCCACCCAACACTGG
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117 CCCTCACCGAACACGGCCGCGAT-GCCATCACCAACTGCGCT-CACCTTG
116 TCCTCACCGAAGACGACCACGATTGCCATCACCGACAG-TATGCACCTTG ********** *** ** **** ********* ** * * *******
165 GGGATATCTTGCTGAC--TT
165 GGGATATATCGCTGACCATT ******* * ****** **
>CH063_01300长度为204nt，>GLRG_08786长度为202nt。二者的一致性为77%。>CH063_01300的G+C含量为43.1%， >GLRG_08786的G+C含量均为42.6%。 内含子②：>Seq1 (69 nucleotides)
>Seq2 (59 nucleotides)
30-69 (22-59) 83%
30 CCAACGAATCTC-A-GTGCGGGGCTAACCTTTCTTCGAATAG 22 CCAAC-AATC-CAAGGTGCGGGGCTAAC-TT-CTTTGAATAG ***** **** * * ************* ** *** ******
>CH063_01300长度为69nt，>GLRG_08786长度为59nt。二者的一致性为83%。 内含子③：>Seq1 (75 nucleotides)
>Seq2 (76 nucleotides)
1-28 (1-28) 85%
1 GTGCGTAGCCAGACCGACGCCAACGGCT 1 GTGCGTAGCCAGACCGACATCATCGACT ****************** ** ** **
>CH063_01300长度为75nt，>GLRG_08786长度为76nt。二者的一致性为85%。
内含子④：>Seq1 (62 nucleotides)
>Seq2 (60 nucleotides)
24-50 (24-50) 82%
24 GGCC-CTGACCGCGAATTCACCGCTAAT 24 GGCCACT-TCCTCGAGTTCACCGCTAAT **** ** ** *** ************
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