不易挥发，可选用__________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。
(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。
(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用______________法进行计数。
(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，______ ℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________ ℃设计后续实验。
解析：(1)油脂可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，被苏丹Ⅳ染液染成红色，因此油脂通常用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色。不易挥发的物质大多采用萃取法进行提取，水蒸气蒸馏法一般用来提取易挥发的物质。(2)能产生脂肪酶的微生物B能利用脂肪(油脂)作为碳源，所以在制备选择微生物B的培养基时，应将油脂作为唯一的碳源。(3)用显微镜直接对微生物进行计数，需要用血细胞计数板。如果对活菌进行计数，则要用稀释涂布平板法涂布平板，培养后统计菌落数目，然后计算出活菌数量。(4)降解等量的油脂，需要的酶量越多，说明此温度下的酶的活力越小。所以三种温度中45 ℃下酶的活力最小。从三种温度下的实验结果可知，40 ℃下酶的活力最大，所以要想测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度，进行后续实验。
答案：(1)苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ) 萃取法 (2)油脂 (3)血细胞计数板 稀释涂布平板 (4)45 40
2．(2015·江苏高考)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：
(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(填序号)。 ①酒精灯 ②培养皿 ③显微镜 ④无菌水
(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是_____________ _______________________________________________________________________ ________________________。
(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________ ________________________。
(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见右图)。图中降解圈大小
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与纤维素酶的____________有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是______(填图中序号)。
(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是
________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
解析：(1)在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。(2)在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆积在培养基表面，影响分离效果。(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。(4)因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。(5)考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下观察在不同温度和pH条件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。
答案：(1)③ (2)培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果 (3)避免培养基污染棉塞
(4)量与活性 ① (5)J4 发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
3．(2014·四川高考节选)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。
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(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________________四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是_________________________。
(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_____________________________________
________________________________________________________________________。 (3)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是____________________________________________，该实验设计是否合理？为
什
么
？
________________________________________________________________________。
解析：(1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要分离出有降解苯磺隆能力的土壤中的某些微生物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。据题意分析知，造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域的第一条线时未从第一区域末端开始。(3)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件同图乙的空白对照。
答案：(1)氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖 (2)接种环 ①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始 (3)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理，缺少空白对照
4．(2013·全国卷Ⅱ)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：
(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用__________法或________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。
(2)取该单菌落适当稀释，用________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__________；含
C
的滤纸片周围的透明圈比含
A
的小，说明
________________________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的
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________。
(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素________。
解析：(1)微生物的常用接种方法为划线法和稀释涂布法。(2)能够使菌落均匀生长、布满平板的接种方法为涂布法。(3)含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A敏感；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B不敏感；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；含D的滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落(排除杂菌污染)，说明该致病菌可能对抗生素D产生了抗药性。
答案：(1)划线 稀释涂布(或涂布) (2)涂布 (3)敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比对A的弱 耐药菌 (4)A
[调研试题重点研究——明趋势]
一、题点练
1．下列有关微生物培养与应用的说法，正确的是( ) A．天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基
B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理 C．大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段 D．分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源
解析：选C 天然培养基是指用天然物质制成的培养基，但也需要加工；实验操作者的双手应消毒，不能灭菌；分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源，不是碳源，需加入不含氮元素的有机物(如葡萄糖)作为碳源。
2．平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是( )
A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D．都会在培养基表面形成单个的菌落
解析：选D 平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法需要将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个的菌落。
3．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是( ) A．土壤取样时应选取距地表约3～8 cm的土壤层 B．测定细菌的数量，一般选用10、10和10倍的稀释液 C．土壤中能合成脲酶的细菌能分解尿素
D．向以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红溶液可以鉴定出分解尿素的细菌
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解析：选D 测定细菌数量，一般选用10、10和10倍稀释液进行平板培养；测定真菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释液；测定放线菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释液。鉴定分解尿素的细菌时需向以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
4．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是( ) A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖 B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
解析：选D 在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
5.在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a、b、c处分别贴浸有不同抗生素(浓度相同)的无菌滤纸片，d处滤纸片浸有无菌水。培养后的结果如图所示。以下判断错误的是( )
A．a处抑菌效果小于b处 B．b处的滤纸片没有沥干 C．c处抗生素无效 D．d为对照
解析：选A 培养皿中不同滤纸片四周透明圈的大小不同，透明圈越大，说明浸有的抗生素抑菌效果越好。a处的透明圈并不小于b处；b处不是圆形的透明圈，可能是滤纸片没有沥干，抗生素流出滤纸片；c处无透明圈，说明c处抗生素对大肠杆菌无效；d为空白对照。
二、题型练
6．农业和林业生产上每年都有大量的富含纤维素的下脚料，如农作物秸秆和木屑等。这些下脚料中的纤维素经过微生物的转化可以形成葡萄糖，而葡萄糖既是生物体内重要的能源物质，也是食品和制药工业的重要原料。请分析回答下列问题：
(1)许多微生物都能产生分解利用纤维素的纤维素酶，这种酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分：__________、__________和__________。在纤维素酶的作用下，农业和林业下脚料中的纤维素最终将被分解为__________。
(2)分解纤维素的微生物可以从土壤中分离获得，分离的基本过程如下：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。其中选择培养的目的是______________________________________________________ ___________________________，选择培养所用的培养基中唯一的碳源是________。鉴别纤
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