电泳法 2.实验操作程序 各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同 样品处理：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液
粗分离：用透析法除去样品中相对分子质量较小的杂质
纯化：用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化
纯度鉴定：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白
进行纯度鉴定
一、理解运用能力 判断下列叙述的正误。
(1)固定化酶常采用化学结合法和包埋法(×) (2)固定化细胞常采用包埋法(√)
(3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小(2012·江苏卷T17A)(√) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌(2012·江苏卷T17D)(√) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液(×) (接下页右栏)
(6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物(×) (7)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗脱出来(×)
(8)在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关(×)
(9)在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移速率完全取决于分子的大小(√) (10)DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头开始合成DNA(√) (11)在PCR技术中，DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸(×) 二、读图析图能力
(接下页右栏)
据酶的固定方式示意图回答问题：
(1)图1、图2、图3各表示酶固定的哪些方式？ 答案：包埋法 化学结合法 物理吸附法
(2)固定化酶和固定化细胞一般常采用什么方法？请分析原因。
答案：酶多适合用化学结合和物理吸附法固定，而细胞外采用包埋法固定。因为细胞个大，难以被吸附或结合；而酶分子很小，容易从包埋材料中漏出。
[理清脉络]
考点一| 固定化酶与固定化细胞技术
1．制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵
酵母细胞的活化(使处于休眠状态的酵母细胞重新恢重正常的生活状态：称取1 g干酵 母，放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使 酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1 h左右，使其活化)
配制物质的量浓度为
0.05 mol/L的CaCl2溶液 ?称取0.83 g无水CaCl2溶于150 mL蒸馏水中?
配制海藻酸钠溶液?称取0.7 g海藻酸钠，放入50 mL小烧杯中，加入10 mL水，用酒精灯 小火间断加热，边加热边搅拌，至完全溶化，定容至10 mL?
海藻酸钠溶液与酵母?混合之前海藻酸钠溶液要冷却至室温，加入已活化的酵母细胞后进 细胞混合
行充分搅拌，混合均匀后，再转移至注射器中?
固定化酵母细胞?将混合液滴在CaCl2溶液中，形成凝胶珠，将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸
泡30 min?
冲洗[将固定好的酵母细胞?凝胶珠?用蒸馏水冲洗2～3次]
发酵?将150 mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200 mL的锥形瓶中，再加入固定好
的酵母细胞，置于25 ℃下发酵24 h?
2．注意事项
(1)细胞的固定化要在严格无菌条件下进行；对制备的海藻酸钠溶液、CaCl2溶液以及注身器等器材进行严格灭菌。
(2)溶化海藻酸钠时采用小火间断加热法，防止海藻酸钠焦糊。
(3)海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；浓度过低，凝胶珠；浓度过低，凝胶珠所包埋的酵母细胞数量少。
[典例1] (2014·安庆模拟)下列有关固定化酵母细胞中的有机物( ) A．实验中需要先利用蒸馏水消耗酵母细胞中的有机物
B．固定酵母细胞的常用方法是吸附法，这种方法对酵母细胞活性影响最小 C．实验中使用CaCl2溶液处理的目的是使酵母细胞处于感受态，提高发酵效率 D．若最终凝胶珠的颜色泛白，可能是由于海藻酸钠溶液的浓度偏低
[解析] 固定化酶母细胞的过程为：活化酶母细胞(利用蒸馏水使干酵母菌恢复正常生活状态)→海藻酸钠、CaCl2溶液的配制(在溶解海藻酸钠的过程中使用小火或间断加热，防止溶液焦糊)→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合(注意冷却海藻酸钠溶液至室温，防止高温破坏酵母菌的活性)→固定化酵母细胞。实验中CaCl2溶液的作用是使凝胶珠形成稳定的结构。若海藻酸钠溶液的浓度过低，会导致固定的细胞数目较少，观察到的凝胶珠颜色浅。
[答案] D
混淆固定化酶与固定化细胞
1．固定化酶和固定化细胞技术的比较
名称 包埋法 化学结 合法 物理吸 附法 原理 将酶或细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中 利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上 通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在纤维素、琼脂糖、多孔玻璃或离子交换树脂等载体上 图示 2．固定化酶与固定化细胞的比较 固定酶的种类 适用方法 优点 特点 缺点 实例 [针对练习]
固定化酶 一种 化学结合法、物理吸附法 酶与反应物结合，又与产物分离，固定在载体上的酶可反复利用 一种酶只能催化一种或一类化学反应 固定化葡萄糖异构酶 固定化细胞 一系列 包埋法 成本低，操作更容易 可能导致反应效果下降 固定化酵母细胞 高考命题常从以下角度设置陷阱
高考对此类问题常结合酵母细胞的固定化，考查固定化酶与固定化细胞技术的区别和联系。
1．(2014·长沙模考)下列说法不正确的是( ) ．
A．固定化酶和固定化细胞的技术方法包括包埋法、化学结合法和物理吸附法 B．固定化酶更适合采用化学结合法和物理吸附法
C．由于细胞个大，而酶分子很小，因此细胞多采用物理吸附法固定 D．反应物是大分子物质时应采用固定化酶
解析：选C 由于细胞个大，酶分子很小，个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。因此，细胞多采用包埋法固定，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定。
考点二| 蛋白质的分离
1．常用的蛋白质分离方法 (1)凝胶色谱法： 蛋白质 比较 凝胶内部 运动方式 运动路程 洗脱次序 (2)电泳法原理： ①在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解离的基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
相对分子质量大 被排阻在凝胶颗粒外面，迅速通过 垂直向下 较短 先流出 相对分子质量小 进入凝胶颗粒内部，被滞留 垂直向下和无规则扩散运动 较长 后流出 ②由于分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
2．血红蛋白的提取和分离
红细胞洗涤——离心去除血清?? ↓
(1)样品的处理?释放血红蛋白——蒸馏水涨破
?? ↓分离血红蛋白—离心处理?2?精分离——透析?去除小分子杂质
(3)纯化——凝胶色谱法进行分离和纯化
(4)纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
[典例2] 下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。我们通常选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_____________________________________________。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶认，则A是________；乙装置中，C溶液的作用是________。 (3)甲装置用于________，目的是__________________________________________。 用乙装置分离蛋白质的方法叫________，是根据____________________________ 分离蛋白质的有效方法。在操作中加样(下图)的正确顺序是________。
(4)最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行________。
[解析] 本题考查血红蛋白的提取和分离的过程和方法。(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，柠